重组人红细胞生成素对癫痫持续状态大鼠海马线粒体凋亡途径相关调控因子的影响及作用机制

目的观察重组人红细胞生成素(r Hu EPO)对戊四氮(PTZ)点燃的癫痫持续状态(SE)的成年雄性(SD)大鼠海马神经元磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响,并进一步探讨r Hu EPO作用的可能机制。方法于2010年3月,由河北省实验动物中心提供的健康清洁级成年SD大鼠。采用PTZ点燃大鼠SE模型,将大鼠随机分为B组(PTZ+0.9%氯化钠溶液)、C组(PTZ+r Hu EPO)、D组(PTZ+LY294002+r Hu EPO)、E组(PTZ+二甲基亚砜+r Hu EPO),同时另选取不进行SE制模的SD大鼠作为A组(0.9%氯化钠溶液),检测大鼠行为学和脑电图的改变;用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测海马神经元的凋亡情况;免疫组织化学法观察p-Akt、Bax、XIAP的阳性细胞数;反转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠海马Bax信使RNA(BaxmRNA)的表达;Western blot方法检测各组大鼠海马蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、XIAP蛋白的表达。结果与B组比较,C组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均增多,Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均减少,差异有统计学意义(P<0.05);与C组比较,D组p-Akt、XIAP阳性细胞数和p-Akt、XIAP蛋白表达水平均减少,Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平均增多,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 r Hu EPO可以提高p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达水平,降低Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达水平,减少海马神经元的凋亡,发挥神经保护作用;加入磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂LY294002后,海马p-Akt、XIAP阳性细胞数及蛋白表达减少、Bax阳性细胞数及BaxmRNA表达增加,海马神经元的凋亡增加,减弱了r Hu EPO的保护作用。因此,PI3K/Akt信号通路是r Hu EPO发挥神经保护作用的通路之一,其作用机制可能是r Hu EPO活化PI3K/Akt后,提高p-Akt蛋白及线粒体凋亡途径相关调控因子XIAP的表达,下调了Bax的表达,从而介导线粒体凋亡途经,发挥抗凋亡、促存活的神经保护作用。

不同浓度骨碎补提取液对体外培养人牙髓细胞增殖及超微结构的影响(英文)

背景:体外培养人牙髓细胞难度很大,国内外已有生长因子对体外培养牙髓细胞增殖分化作用的研究,而中药骨碎补对体外培养牙髓细胞的影响,经作者检索未见报道。目的:观察不同浓度骨碎补提取液对体外培养的人牙髓细胞增殖分化的影响。设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-03/2007-05在河北医科大学第四医院科研中心完成。材料:人牙髓细胞组织选自河北医科大学第四医院口腔科要求正畸治疗需拔除的健康阻生智齿着,取得所有供者对标本采集的知情同意。产地云南的骨碎补购自河北医科大学第四医院中药房。方法:采用组织块法体外培养人牙髓细胞。水提醇沉法提取骨碎补有效成分,以每1mL药液含生药1g加入积体分数为0.02的胎牛血清培养液,稀释成质量浓度为10,50,100,500,1000mg/L。分别以此培养液作用于体外培养的人牙髓细胞,以不加骨碎补提取液培养的细胞做对照。主要观察指标:①人牙髓细胞原代培养和来源鉴定。②四甲基偶氮唑盐法检测各质量浓度组骨碎补对人牙髓细胞增殖的作用。③免疫组织化学法观察各浓度组骨碎补对人牙髓细胞纤维连接蛋白的表达。④扫描电镜和透射电镜下观察骨碎补对人牙髓细胞超微结构的影响。结果:原代培养的人牙髓细胞呈梭形或多角形。各浓度骨碎补均对体外培养的人牙髓细胞有促增殖作用,其中以100mg/L浓度组促增殖作用最明显,可诱导牙髓细胞合成、分泌纤维连接蛋白。电镜下实验组人牙髓细胞表面枝状嵴丰富,细胞周围可见细胞外基质,细胞浆内有丰富粗面内质网和游离的核糖体,核内常染色质均匀分散,异染色质少。结论:含100mg/L骨碎补培养液对体外培养的人牙髓细胞有明显的促增殖作用。

氧化应激对大鼠髓核细胞凋亡的影响

背景:细胞凋亡在椎间盘退变过程中发挥重要作用,而导致细胞凋亡的因素很多,氧化应激是导致细胞凋亡的一个重要因素。目的:从细胞内信号转导水平验证过氧化氢对大鼠髓核细胞氧化应激损伤的影响。设计、时间及地点:单一样本观察,试验于2008-03/10在山东省创伤骨科研究所完成。材料:p38MAPK特异性阻断剂(SB203580)、JNK特异性阻断剂(SP600125)购自碧云天生物技术有限公司;大鼠椎间盘来自2只新生24h SD大鼠。方法:原代培养大鼠髓核细胞,将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液,随即分为4组:H202组:用0,50,100,200,400,800μmol/L H2O2刺激;对照组:不加刺激的细胞;SB203580+H2O2组:给予特异性p38MAPK阻断剂SB203580预孵育细胞,再给予H2O2刺激;SP600125+H2O2组:给予特异性JNK阻断剂SP600125预孵育细胞,再给予H2O2刺激。上述处理后检测相关指标。主要观察指标:以免疫组织化学检测P-p38和P-JNK的表达情况及表达位置;Western印迹法检测SAPK/JNK、p38MAPK及其磷酸化组分的表达。结果:H2O2能够激活髓核细胞内p38和JNK的活性;SB203580能够有效地抑制p38MAPK的活性,而SP600125则能够有效的抑制JNK的活性;免疫荧光显示P-p38MAPK和P-JNK在细胞质和细胞核均有表达中,而对照组未发现。结论:大鼠髓核细胞受氧化应激后可通过p38MAPK和JNK通路导致细胞凋亡。

卷曲螺旋结构域蛋白74B对纤毛生成和细胞周期调控作用研究

背景卷曲螺旋结构域蛋白(CCDC)参与基因转录、细胞凋亡及细胞周期过程,并调控恶性肿瘤细胞的侵袭和转移等多种生物学行为,然而多数CCDC的生物学功能目前尚未明确。目的探讨CCDC74B的细胞定位及对纤毛生成和细胞周期的影响。方法 2013年3—9月通过构建在人视网膜色素上皮(RPE1)中的Tet-On表达系统,实现CCDC74B在细胞内的蛋白表达,然后通过细胞免疫荧光染色观察CCDC74B的细胞定位,通过小干扰RNA(siRNA)转染敲除CCDC74B在RPE1细胞中的表达,分为对照组、siRNA#1组、siRNA#2组,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测CCDC74B mRNA表达水平;采用细胞免疫荧光染色及流式细胞术观察下调CCDC74B表达后纤毛生成情况和对细胞周期分布的影响。结果在正常上皮细胞中,CCDC74B位于中心体,细胞免疫荧光染色示,下调CCDC74B表达后细胞初级纤毛生成。siRNA#1组及siRNA#2组转染后36 h及48 h纤毛生成率分别高于对照组(P<0.05)。RT-PCR法结果显示,siRNA#1组及siRNA#2组均有效抑制了CCDC74B mRNA表达。细胞免疫荧光染色示,下调CCDC74B表达后cyclin A表达减少,提示存在细胞周期停滞;流式细胞术检测示,下调CCDC74B表达后G_1期细胞比例增高,S期及G_2/M期细胞比例减少。结论中心体蛋白CCDC74B在细胞增殖过程中参与对纤毛生成和细胞周期的调控。

内毒素脂多糖促进人牙髓成纤维细胞凋亡及其对caspase-3活性的影响

目的观察内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对体外培养的人牙髓成纤维细胞的致凋亡作用及其对凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影响。方法不同浓度(0μg、100μg、200μg、400μg/mL)的LPS作用细胞,采用噻唑蓝比色法检测LPS对细胞增殖的影响;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡;流式细胞术检测细胞周期及凋亡;化学比色法检测细胞凋亡过程中caspase-3活性的变化。结果不同浓度LPS组细胞的生长与对照组相比均受到显著的抑制(P<0.01),细胞增殖抑制率呈剂量依赖关系;Hoechst33258荧光染色显示,给药组部分细胞呈典型的凋亡表现;流式细胞术检测结果显示,不同浓度的LPS作用细胞48h,细胞的凋亡率分别为9.2%,23.8%,31.4%;caspase-3活性检测显示,其活性呈剂量依赖性增高,LPS浓度达到400μg/mL时,其活性为对照组的3.4倍。结论LPS可显著地抑制人牙髓成纤维细胞增殖、诱导细胞凋亡、升高caspase-3活性,并呈明显的量效关系。

pIRES-p16ink4a-hRb1载体的构建及其对骨肉瘤细胞周期的调控

目的应用内部核糖体插入位点(IRES)序列构建单启动子双顺反子穿梭载体pIRES-p16ink4a-hRb1并鉴定,观察其导入骨肉瘤细胞后对细胞周期的调控。方法利用基因工程技术,将p16ink4a与hRb1全长cDNA编码区依次亚克隆至pIRES载体中,质粒构建通过PCR、双酶切与测序鉴定;脂质体转染至p16ink4a表达缺失、hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MG63,G418筛选获得抗性克隆,通过RT-PCR和Western blot法分析外源基因表达;流式细胞术分析细胞周期特异性和细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果成功构建出pIRES-p16ink4a-hRb1载体,外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。与对照组比较,双基因导入组细胞生长抑制率显著上升,细胞周期显著阻滞在G1期,且细胞凋亡率极显著升高。结论pIRES-p16ink4a-hRb1双顺反子穿梭载体的构建与真核细胞导入、目的基因表达成功,为进一步研究p16ink4a与hRb1相互关系在细胞周期调控中的作用奠定了基础。

外周血淋巴细胞凋亡依赖于细胞周期运行

目的以培养的人类正常外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs)为模型,模拟细胞周期运行的不同状态,研究细胞凋亡与细胞周期运行的关系。方法将PHA及咖啡因处理前后的PBLs,分别用喜树碱(CPT)、X-射线、抗Fas抗体和肿瘤坏死因子TNF-α诱导,流式细胞术方法对细胞凋亡进行定量检测。结果PBLs经PHA刺激后进入细胞周期并发生凋亡,在凋亡因子打击作用下凋亡明显增加,用咖啡因废除细胞周期检测点后对凋亡打击敏感性降低。未经PHA刺激的PBLs对凋亡打击无应答。结论细胞进入细胞周期总是伴随细胞凋亡的发生,细胞不进入周期,则不会发生凋亡,细胞周期不停止,也不会凋亡。细胞周期检测点是联结细胞周期和细胞凋亡的重要位点。

鼠破骨细胞培养过程中凋亡现象的观察研究

目的观察研究鼠破骨细胞培养过程中的凋亡现象。方法对机械分离法获得的鼠破骨细胞进行形态学、特异性耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及硬组织吸收实验鉴定。实验分为12h、24h、48h、72h组,分别在相应培养时间点行TRAP染色,计数每组阳性红染破骨细胞量。结果机械分离法获得的鼠破骨细胞形态较大,TRAP染色见胞质呈酒红色不均匀沉淀,能形成不规则硬组织吸收陷窝。随着实验组培养时间的延长,TRAP阳性破骨细胞数量呈下降的趋势。在培养48h内,细胞数量减少不明显,当到达72h后,细胞数量明显减少。结论鼠破骨细胞在培养过程中因细胞凋亡发生细胞数逐渐减少。

氧浓度及Notch通路对大鼠纤维环细胞增殖和细胞周期的影响

目的检测不同氧浓度条件下椎间盘纤维环细胞Notch信号通路相关分子的表达变化,明确参与调节纤维环细胞增殖的相关靶基因。方法体外分离、培养大鼠纤维环细胞,运用CCK-8细胞活力检测试剂盒、流式细胞仪检测不同氧浓度培养条件下Notch信号通路抑制剂L685458（2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L）对纤维环细胞增殖及细胞周期的影响;荧光定量RT-PCR检测不同氧浓度培养条件下纤维环细胞Notch信号表达水平变化。结果 CCK-8结果显示与常氧条件相比,低氧培养纤维环细胞时所测吸光度值明显升高;无论常氧或低氧条件,加入Notch抑制剂干预后所测吸光度值明显降低;流式细胞仪结果显示与常氧条件相比,低氧培养纤维环细胞处于S/G2期细胞所占百分率明显升高,加入Notch抑制剂干预后处于S/G2期细胞所占百分率明显降低。低氧干预8~24 h后,Notch3、Notch4、Delta-like1、Delta-like3、Hes1、Hes5、Hes7 mRNA都有不同水平上调,Hey2 mRNA表达水平下调。结论低氧可以通过上调Notch信号通路的表达水平促进纤维环细胞增殖,Notch信号可能作为一个研究靶点用于延缓椎间盘退变的过程。

吉非替尼对人肺腺癌A549干细胞增殖的影响

目的从人肺腺癌A549细胞系分离出SP亚群细胞,并观察吉非替尼对其生长增殖、细胞周期的影响。方法经Hoechst33342和碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪分离出具有干细胞特性的SP亚群。用0～40μmol.L-1浓度的吉非替尼和SP细胞共培养24、48、72h,采用MTT法检测吉非替尼对细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测其对细胞周期分布的影响。结果 SP亚群占A549细胞的1.89%,维拉帕米阻断后减少为0.39%。吉非替尼在0～40μmol.L-1浓度范围内能明显抑制A549细胞的增殖,并存在浓度和时间依赖性。流式细胞仪检测显示吉非替尼抑制A549SP细胞增殖是通过阻滞细胞周期使其停留在G0/G1期实现的。结论 A549细胞中存在SP细胞亚群,吉非替尼抑制A549干细胞的增殖是通过阻滞A549SP细胞于G0/G1期实现的。

大鼠磨牙上皮根鞘发育的组织学观察

目的观察SD大鼠磨牙上皮根鞘的发育。方法选择出生后0、5、10、15、25 d的SD大鼠,制备大鼠下颌组织切片,抗角蛋白14免疫组化染色。结果 SD大鼠磨牙上皮根鞘在其出生后5 d时开始形成,出生后15 d时开始断裂,出生后25 d时大部分发生断裂,根尖处部分保持完整。结论大鼠磨牙上皮根鞘有序发生、生长和断裂,可作为研究人类牙根发育的动物模型。

没食子儿茶素没食子酸酯抑制牛主动脉内皮细胞增殖和对细胞周期分布的影响

背景:血管内皮细胞在肿瘤血管生成中起关键作用,没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)可抑制内皮细胞生长和增殖,但其作用机制仍不清楚。目的:观察没食子儿茶素没食子酸酯对牛主动脉内皮细胞增殖和细胞周期分布的影响。设计、时间及地点:以细胞为观察对象的随机分组实验,于2006-08/2008-05在广州医学院完成。材料:出生1d、未哺乳的新生牛,取主动脉内皮细胞进行原代培养。方法:将指数生长期密度为5×107L-1的牛主动脉内皮细胞接种于96孔培养板,实验分为2组:实验组和对照组分别加入以培养基RPMI1640配制的不同浓度的EGCG180μL(终浓度为5,10,20,40,80g/L)及等体积不含EGCG的培养基,全自动酶标仪上测定不同时间3,6,12,24,36h各孔吸光度值,并计算细胞生长抑制率。选择适当的药物浓度和作用时间点进行EGCG抑制作用的半数抑制浓度(IC50)实验。收集对数生长期的牛主动脉内皮细胞,实验组加入不同浓度(10,20,30,40g/L)的EGCG,对照组加入不含药物的培养基,Multicycle软件分析G1/G0期、S期和G2/M期细胞所占比例。主要观察指标:①不同剂量EGCG在不同时间点对牛主动脉内皮细胞生长、增殖的影响。②运用直线回归分析EGCG对牛主动脉内皮细胞抑制的IC50。③流式细胞仪检测EGCG对内皮细胞周期分布的影响。结果:①EGCG呈剂量及时间依赖性抑制内皮细胞的增殖:EGCG作用12h后,细胞抑制率达高峰,此后其抑制率逐渐下降(P<0.05);从10g/L起,EGCG对内皮细胞增殖的抑制效应逐渐增加,40g/L即达高峰(P<0.05);40g/L与80g/L剂量组相比,抑制率无明显差异(P>0.05)。②在3,6,12,24h和36h等时间点EGCG的IC50分别为23.14,18.79,13.23,14.19,17.45g/L,IC50在12h达高峰,时间继续延长,作用并不增加。③各组G2/M期细胞所占比率无明显差异(P>0.05)。S期细胞比率由(58.02±1.21)%下降为(27.62±3.12)%,其中30g/L和40g/L剂量组与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.01)。G0/G1期细胞比率由(29.22±3.21)%上升到(62.32±4.11)%,其中30g/L和40g/L剂量组与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:EGCG在体外能有效抑制牛主动脉内皮细胞增殖,且使其周期主要受阻于G0/G1期,可能是其抑制内皮细胞增殖的机制之一。

氧化型低密度脂蛋白诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖及周期素D1的表达

背景:氧化型低密度脂蛋白可通过Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径诱导血管平滑肌细胞增殖及细胞周期蛋白的表达。目的:观察胞外信号调节激酶是否参与了氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞周期推进以及周期素D1的表达。设计、时间及地点:对照观察细胞学实验,于2008-02/10在广州医学院完成。材料:人血浆低密度脂蛋白来自健康志愿者血清。SD大鼠由广州医学院实验动物中心提供。方法:采用超速离心法分离人低密度脂蛋白进行氧化修饰及鉴定。以酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞,采用免疫组织化学染色法鉴定。主要观察指标:在静止的血管平滑肌细胞中加入MEK1/2选择性抑制剂10μmol/LPD98059和/或50mg/L氧化型低密度脂蛋白,以CCK-8和细胞计数法测定细胞增殖,流式细胞术观察细胞周期,蛋白印迹检测周期素D1蛋白表达及胞外信号调节激酶的活性。结果:CCK-8和细胞计数法显示,氧化型低密度脂蛋白能明显诱导血管平滑肌细胞增殖,PD98059抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖,并且呈时间依赖性。流式细胞术分析表明,经氧化型低密度脂蛋白处理24h后,血管平滑肌细胞从G0/G1期进入S期,S期细胞百分比明显增高(P<0.01),加入PD98059处理24h后,血管平滑肌细胞由G0/G1期向S期的推进受到抑制。蛋白印迹结果显示,氧化型低密度脂蛋白能明显诱导周期素D1蛋白表达及胞外信号调节激酶的磷酸化,PD98059抑制氧化型低密度脂蛋所诱导的周期素D1蛋白表达以及胞外信号调节激酶的磷酸化。结论:氧化型低密度脂蛋白能诱导血管平滑肌细胞增殖,促进细胞由G0/G1期向S期转换以及周期素D1表达,其作用部分是由胞外信号调节激酶所介导。

反义抑制miRNA-155对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响

目的观察转染反义微小核糖核酸(miRNA)-155对人皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的影响。方法采用脂质体介导对皮肤鳞状细胞癌A431细胞转染miRNA-155无义序列(阴性对照组)、转染反义miRNA-155(转染组),空白对照组细胞不作处理。实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测转染后A431细胞miRNA-155的相对表达水平;采用四甲基偶氨唑盐(MTT)检测转染后皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖活性;采用流式细胞术(FCM)检测转染后皮肤鳞状细胞癌A431细胞周期改变和凋亡变化;采用Transwell法检测侵袭力与细胞迁移能力。结果转染组A431细胞中miRNA-155 mRNA的相对表达水平低于空白对照组和阴性对照组(F=634.57,P<0.01),但空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义。转染72 h后,转染组较空白对照组和阴性对照组细胞存活率明显降低,转染120 h降低最为明显(P<0.05)。转染组G_0/G_1期细胞增多,S期细胞减少,整体细胞增殖指数降低,A431细胞凋亡率、细胞迁移和侵袭力升高(P<0.05),但各组G_2/M期细胞周期变化、后2组A431细胞凋亡率、细胞迁移和侵袭力差异无统计学意义。结论皮肤鳞状细胞癌A431细胞转染反义miRNA-155可减少miRNA-155的表达,有效抑制A431细胞增殖,促进其凋亡。miRNA-155可能成为治疗皮肤鳞状细胞癌基因表达调控的新靶点。

单独或联合应用酸性成纤维细胞生长因子与转化生长因子对猪牙乳头细胞增殖的影响

目的研究酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）和转化生长因子（TGF）β1单独或联合应用后对猪牙乳头细胞（pDPCs）增殖的影响。方法通过体外细胞培养技术,用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测aFGF、TGFβ1不同浓度、不同时间单独及联合应用后对pDPCs增殖的影响,所得数据用单因素方差进行分析。结果aFGF在5~100ng/ml和8d范围内能促进pDPCs增殖,最强效应浓度为10ng/ml和25ng/ml,最强效应时间为8d;TGFβ1在5~50ng/ml和8d范围内能抑制pDPCs增殖,其中以5ng/ml和10ng/ml抑制作用较弱;以aFGF最强效应浓度与TGFβ1较弱抑制浓度交互联合后对pDPCs有显著的促进增殖作用,其中以aFGF25ng/ml＋TGFβ110ng/ml的效果最明显。

Cyr61对急性肾损伤保护作用及其机制研究进展

富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)是一种分泌蛋白,在肾脏发生缺血再灌注损伤后,可在近端小管上皮中检测到Cyr61的表达,Cyr61可能对肾脏细胞具有一定的保护作用。对Cyr61在缺血性急性肾损伤(AKI)中作用及机制进行研究,可为AKI的诊断和治疗提供更多的理论依据。

异时相Cyclin B1/CDK1表达有助于正常在体细胞进入细胞分裂周期

目的研究通常表达于G2/M期的Cyclin B1在G1期异时相表达的作用机制及意义。方法用丝裂原刺激因子(PHA)刺激人外周血淋巴细胞使之进入细胞周期,分别在刺激后0、36、48、60 h收集细胞,并分成两部分,一部分用流式Cyclins/DNA多参数技术分析,一部分用Post-sorting Western blot分析。结果处于G0期的淋巴细胞经PHA刺激进入细胞周期后,可以观察到Cyclin B1在G1期有异时相表达,相应的CDK1亦有异时相表达。结论异时相Cyc-lin B1/CDK1可能有助于正常在体细胞进入细胞分裂周期。

C3H10T1/2成软骨分化过程中miR-19a与CCND1的表达及调控

【目的】在间充质干细胞诱导成软骨分化过程中,探讨mi R-19a与细胞周期基因CCND1之间的关系,为揭示mi R-19a参与调控成软骨分化的可能机制提供基础。【方法】选取小鼠间充质干细胞C3H10T1/2为研究对象,运用离心沉淀法进行pellet细胞微球培养,用含有TGF-β3及2%FBS的高糖DMEM进行成软骨诱导并作为实验组,用含2%FBS的高糖DMEM培养(替换)导作为对照组。分别在1、2、3周进行定量PCR检测成软骨分化相关基因表达以及在第3周进行甲苯胺蓝染色。【结果】与对照组比较,细胞功能基因Bax与Klf-4表达均下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。成软骨分化关键启动因子SOX-9及相关基因aggrecan,collagen II,Collagen Xa1的表达均在2周时显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。通过互联网生物信息学预测CCND1可能是mi R-19a的靶基因;在成软骨分化过程中,mi R-19a表达逐渐上升(P<0.05),而CCND1的表达与对照组相比逐渐下降(P<0.05)。甲苯胺蓝染色pellet细胞微球呈蓝紫色,细胞核呈深蓝色,诱导组中细胞外基质含量明显增多。【结论】在C3H10T1/2成软骨分化过程中,mi R-19a参与维持细胞干性及增殖基因表达降低,分化能力得到增强;且mi R-19a参与该分化调控过程。

慢病毒介导I型胶原短发夹RNA转染对大鼠系膜细胞生长行为的影响

目的通过观察慢病毒介导的I型胶原（COLI）短发夹（sh）RNA感染大鼠系膜细胞后其增殖、凋亡及细胞周期的变化，探索未来应用于动物实验，甚至临床时RNA干涉（RNAi）药物对靶细胞生长行为的影响。方法利用感染增强剂（对照组）、空慢病毒载体及感染增强剂（pSC-GFP组）、COLIshRNA慢病毒表达载体及感染增强剂（pSC—GFP／COLI组）分别感染大鼠系膜细胞，用噻唑蓝法检测细胞增殖，利用AnnexinV／PE法检测细胞凋亡，利用流式细胞仪检测细胞周期，进而观察慢病毒表达载体对细胞上述能力的影响。结果pSC—GFP／COLI组和pSC—GFP组均能显著抑制细胞增殖，且慢病毒表达载体抑制能力又显著高于空病毒，分别于感染后24h、48h和72h计算抑制效率为22．52％、28．57、33．33％。凋亡实验结果表明，慢病毒感染细胞后一定程度诱导了细胞凋亡，但作为载体携带的COLIshRNA未引起进一步的细胞凋亡加剧。细胞周期实验发现慢病毒引起细胞周期阻滞于G2／M期。而在72hCOLIshRNA对s期的阻滞逐渐突出。结论慢病毒介导I型胶原短发夹RNA转染大鼠系膜细胞后，在一定程度上影响了细胞生长行为，但总体来说仍是安全的，为进一步动物实验及药物研制奠定基础。