PRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的用PRS逆转录病毒载体构建介导人结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达的PRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体,并建立高效、稳定表达CTGF-SiRNA的包装细胞株。方法根据siRNA靶序列设计要求及PRS逆转录病毒载体特点分别设计含64bp DNA序列的4对寡核苷酸,并在体外合成。PRS载体用BglII、HindIII双酶切完全后,分别与退火的4对寡核苷酸进行连接,构建成表达CTGF小分子干扰RNA的PRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体。用脂质体2000介导转染PT67包装细胞,经抗性筛选,挑单克隆,扩大培养,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出高效产毒细胞株。结果经酶切、连接后构建成的质粒称之为PRS-CTGF-SiRNA1～4,经酶切与测序证实构建成功,无任何碱基突变。经脂质体介导转染包装细胞、抗性筛选和NIH3T3测定病毒滴度,筛选出具有高病毒滴度的细胞集落,扩大培养后建立CTGF-SiRNA高效表达的包装细胞株。结论成功构建了能表达CTGFsiRNA的PRS-CTGF-SiRNA逆转录病毒载体,并建立了稳定、高效生产有活性的的CTGF-SiRNA产毒包装细胞株。

碱性成纤维细胞生长因子对表皮细胞中端粒酶反转录酶表达的影响

目的观察表皮细胞去分化过程中人端粒酶反转录酶(hTERT)的表达差异及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的影响。方法采用bFGF诱导表皮细胞去分化形成表皮前体干细胞,免疫细胞化学染色法检测bFGF诱导培养后表皮细胞表型的改变,并用流式细胞法、免疫荧光染色及TRAP-银染法检测bFGF诱导培养后表皮细胞中hTERT的表达差异。以同等条件下未经bF-GF处理的人表皮细胞为对照组,同期分离培养的人在体表皮干细胞为阳性对照组。结果免疫细胞化学染色显示,bFGF诱导培养后表皮细胞中β1-integrin、CK19、CK14表达明显增强,而CK10表达明显降低。流式细胞仪检测显示,bFGF诱导后实验组、对照组及阳性对照组hTERT阳性的细胞亚群分别占被检测细胞总数的98.41%、0.77%及99.76%。TRAP-银染法检测显示实验组hTERT表达活性明显上调,且与阳性对照组比较无显著差异。间接免疫荧光染色显示实验组去分化来源表皮干细胞和在体表皮干细胞中的hTERT分布存在着亚细胞位点差异。结论 bFGF可诱导表皮细胞去分化并重新获得表皮干细胞的表型,这一过程不但可引起hTERT的表达及活性改变,而且能从亚细胞水平上诱导其发生位点迁移。

Jmjd3基因RNAi慢病毒载体构建及转染BMSCs效应的实验研究

目的构建针对SD大鼠Jmjd3基因RNAi慢病毒载体,转染大鼠骨髓间充质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)后观察其对Jmjd3基因的抑制作用并筛选最有效干扰序列。方法设计4对Jmjd3基因shRNA寡核苷酸序列,插入pGCSIL-GFP载体形成重组载体。重组载体经过测序鉴定后转染293T细胞生产病毒液,病毒液转染大鼠BMSCs,Western blot分析转染前后Jmjd3表达情况。通过计算Jmjd3灰度值/ACTIN灰度值,筛选出最有效的干扰序列。结果测序结果证实Jmjd3基因shRNA寡核苷酸序列正确插入载体中,成功构建4个大鼠Jmjd3基因RNAi表达载体。Western blot检测显示转染后Jmjd3蛋白表达显著下调,半定量分析显示相对于未转染组,shRNA-1组、shRNA-2组、shRNA-3组、shRNA-4组分别下调79.5%(P<0.001)、90.7%(P<0.001)、73.7%(P<0.001)、56.5%(P<0.001),而GFP组下调11.5%(P>0.05),shRNA-2组为最佳干扰序列。结论针对大鼠Jmjd3基因RNAi慢病毒载体构建成功,并能有效抑制BMSCs中Jmjd3基因的表达。

RNA干扰技术的应用新进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)被发现十年来在生物研究领域已经得到了长足的发展,并且已经初步显示出了巨大的潜力。本文综述了介导SiRNA方法的研究及其在基础研究、疾病模型建立和药物研究中的最新应用进展。

白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α对人正常髓核细胞基质金属蛋白酶-28转录影响的研究

目的探讨白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)对髓核细胞的基质金属蛋白酶-28(matrix metalloproteinase-28,MMP-28)是否具有调控作用。方法培养人体正常髓核细胞,将3个不同浓度的IL-1β(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)和3个不同浓度的TNF-α(0 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL)分别与体外扩增的第3代髓核细胞联合培养72 h,采用实时聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)法测定MMP-28 mRNA的转录水平,采用单因素方差分析法比较转录水平的差异。结果不同浓度(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)的IL-1β与髓核细胞共培养72 h后,各组间MMP-28mRNA转录水平(0.325±0.019、0.343±0.018、0.343±0.018)差异无统计学意义(P>0.05)。不同浓度(0 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL)TNF-α与髓核细胞共培养72 h后,各组间MMP-28 mRNA转录水平(0.325±0.019、0.515±0.02、0.610±0.012)差异有统计学意义(P<0.01),且高浓度组MMP-28 mRNA转录水平较低浓度组明显升高(P<0.01)。结论 IL-1β对正常人体髓核细胞MMP-28转录无调控作用,而TNF-α可以上调MMP-28mRNA转录水平,且呈浓度依赖性。

肿瘤坏死因子α调控启动子活性促进netrin-1的表达

目的探讨TNF-α对netrin-1基因表达的影响,并对其调控机制作初步研究。方法采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测TNF-α对netrin-1表达的影响。用PCR反应扩增netrin-1启动子序列,克隆至pGL3荧光素酶报告基因载体,转染HEK-293A细胞,通过检测荧光素酶活性观察TNF-α对netrin-1转录水平的表达调控。结果 TNF-α(20ng/ml)能上调netrin-1的表达。成功构建pGL3-netrin-1-promoter荧光素酶表达载体,并证实构建的报告基因载体启动子具有活性;发现TNF-α可使netrin-1启动子活性增加(P<0.05),并以剂量和时间依赖方式调节netrin-1启动子的活性。结论细胞因子TNF-α可能通过调控启动子的活性而调节netrin-1的表达。

体外siRNA-GAS5干扰肝癌HepG2细胞生物学行为改变

目的探究生长特异性调节转录因子5(GAS5)在肝癌组织表达及GAS5小干扰RNA(siRNA-GAS5)转染对HepG2肝癌细胞的侵袭增殖的影响,并进一步分析其可能的调控机制。方法选取手术肝癌切除的癌组织及其癌旁组织20例,qRT-PCR检测肝癌及其癌旁组织长链非编码RNA GAS5(GAS5)表达以及Western blot检测周期依赖性蛋白激酶6(CDK6)表达。利用脂质体转染siRNA-GAS5干扰HepG2细胞株中GAS5表达水平,划痕实验、Transwell和CCK-8检测转染后HepG2细胞的迁移、侵袭及增殖能力,流式细胞仪检测干扰后HepG2细胞凋亡周期变化。Western blot、qRT-PCR验证细胞周期调控蛋白周期素D1(Cyclin D1)、CDK6、E2F-1表达。结果肝癌组织中GAS5表达水平低于对应癌旁组织,CDK6表达高于癌旁组织。转染siRNAGAS5的HepG2细胞迁移侵袭增殖能力明显增强。转染siRNA-GAS5的HepG2细胞Cyclin D1、CDK6、E2F-1蛋白表达下降,干扰后的HepG2细胞周期发生G1/S期改变。结论GAS5在肝癌组织的表达出现下调;GAS5可明显抑制肝癌细胞迁移、侵袭及增殖能力;GAS5调控肝癌细胞周期变化可能是通过Cyclin D1/CDK6/E2F-1通路。

基因转录与pre-mRNA剪接的偶联蛋白

真核基因的表达是一个复杂的过程,包括转录、pre-mRNA剪接、翻译等步骤。其中转录和pre-mRNA的剪接是基因表达中的两个重要环节,它们都要通过复杂的蛋白复合物来执行功能。目前研究发现这两个过程并不是绝对独立的,而是偶联在一起同时进行的。多种蛋白的偶联作用将二者联系在一起。RNA聚合酶Ⅱ、SKIP、SMN以及新近发现的人类P100蛋白不仅参与基因转录调节,同时它们在剪接加工中也具有相应的作用。

外泌体在侵袭性前列腺癌中的研究进展

一、前言前列腺癌(Prostatic Cancer, PCa)是全球男性癌症死因的第二大因素,据2018年的流行病学统计,全球有近128万新发病例和35.9万死亡病例[1]。PCa分为惰性PCa和侵袭性PCa,惰性前列腺癌通常指Gleason评分≤6分、分期T2a、癌灶总体积≤0.5ml,侵袭性前列腺癌通常指Gleason评分>7分、癌灶总体积>0.5ml或穿刺肿瘤直径>6mm。侵袭性PCa通常会在局部浸润或向远处转移至其他器官,从而导致较高的死亡率[2]。