单细胞测序和空间转录组技术在口腔医学的应用进展

单细胞测序和空间转录组技术在生命科学领域的应用是近年的研究热点,通过联合单细胞测序及空间转录组技术,能够在单细胞水平揭示细胞特定空间位置上的信息,以进一步探究疾病发生发展的机制及疾病的防治。在口腔医学领域,这一技术已被应用于口腔组织干细胞、口腔组织发生发育、口腔微生物及各类口腔疾病的研究中。该文阐述了单细胞测序和空间转录组技术在口腔领域的应用进展并展望两者联合应用的前景,以期为口腔疾病的诊疗提供新思路。

ZBTB20基因干扰腺病毒的制备及功能鉴定

目的制备靶向锌指和BTB结构域蛋白20(ZBTB20)基因的干扰腺病毒。方法根据ZBTB20基因序列设计人鼠通用的干扰序列,定向克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-U6-GFP的Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点,获得重组穿梭载体pShuttle-shZBTB20。将PmeⅠ酶切线性化的重组穿梭载体pShuttle-shZBTB20导入含有腺病毒载体pAdEasy-1的BJ5183细菌,使其同源重组产生重组腺病毒载体pAd-shZBTB20。用PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒载体,转染293A细胞包装腺病毒颗粒,用半数组织培养物感染量(TCID50)法鉴定病毒滴度,并在人肝癌Huh7细胞和小鼠肝脏组织中验证该病毒的干扰效率。结果成功构建了人鼠通用的ZBTB20基因干扰腺病毒载体,获得高活性的ZBTB20干扰腺病毒Ad-shZBTB20,滴度为3.2×10^(10)IU/mL。该干扰腺病毒感染人肝癌细胞株96 h可使ZBTB20m RNA降低至对照的20%;小鼠尾静脉注射重组病毒(1×10^(10)VG/只)7 d后可下调肝脏内源性ZBTB20蛋白的表达,并使其靶基因甲胎蛋白mRNA表达水平升高约203倍。结论所制备的ZBTB20干扰腺病毒能有效抑制人和小鼠ZBTB20的表达及其生物学效应。

缺氧预处理间充质干细胞来源的外泌体在骨再生中作用的研究进展

间充质干细胞具有自我更新、分化和免疫调节作用,被广泛应用于再生医学中,但其存在移植后存活率低和潜在的致瘤性等缺点。近年来许多研究证实间充质干细胞的生物学功能是通过其释放的外泌体实现的,基于外泌体的无细胞疗法引起了广泛关注。缺氧预处理可以模拟间充质干细胞的生理状态,使细胞分泌的外泌体具有更佳的促进骨再生能力。该文综述了近年来有关缺氧预处理间充质干细胞来源的外泌体在骨再生中作用的研究进展,并讨论了相关机制,最后对其应用于临床需解决的问题进行了探讨。

基因芯片技术在非综合征性耳聋快速基因诊断中的应用研究

目的应用耳聋基因芯片对非综合征性感音神经性耳聋患者进行分子病因学研究,评估其在快速耳聋基因诊断中的可行性。方法采集158名来自北京第三聋哑学校的非综合征性耳聋学生的外周血,提取基因组DNA,用耳聋基因芯片检测四个国人中常见的耳聋相关基因中的9个热点突变,包括GJB2(35delG,176del16bp,235delC及299_300delAT),GJB3(538C>T及547G>A),SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)和线粒体DNA 12S rRNA(A1555G)。同时,应用酶切法或直接测序法分别对线粒体12SrRNA A1555G突变,以及GJB2、SLC26A4基因编码区序列进行检测,以验证基因芯片结果的准确性。结果在158名耳聋患者中,基因芯片方法共检出67例携带致聋突变(42.41%)。其中,线粒体DNA 12S rRNA A1555G突变5例(3.16%);GJB2基因突变39例(24.68%),包括235delC纯合突变24例,235delC和299_300delAT复合杂合突变7例,235delC单杂合突变5例,299_300delAT单杂合突变2例,35delG单杂合突变1例;SLC26A4基因突变22例(13.92%),包括IVS7-2A>G纯合突变5例,IVS7-2A>G和2168A>G复合杂合突变5例,IVS7-2A>G单杂合突变11例,2168A>G单杂合1例;另外还有1例患者检出299_300delAT和IVS7-2A>G双杂合突变。未检出GJB3基因突变。除两例纯合235delC被判读为杂合外,基因芯片的结果同酶切及测序方法结果一致,后者的阳性患者检出率为70例(44.3%),与芯片检测结果相比无统计学差异(P=0.250)。经探针优化后,上述两例误判的235delC样品的芯片检测结果均与测序方法一致,同时经测序证实的其他22例235delC纯合突变样品验证,基因芯片的结果均与测序结果一致。结论针对国人常见耳聋相关基因热点突变设计的耳聋基因芯片对非综合征性重度和极重度耳聋患者的突变检出率高(42.41%)。与传统方法相比,它具有快速、高通量、高准确性、低成本等特点,能够满足临床耳聋基因检测的要求;且其操作简单,易于标准化,适于推广,显示出广阔的临床应用前景。

GJB2、SLC26A4基因致病性突变与内耳CT表型关系的研究

目的研究感音神经耳聋GJB2、SLC26A4基因致病性突变与内耳CT表型之间的关系,探讨这两种基因检测在诊断感音神经性耳聋患者是否存在内耳畸形方面的作用。方法按DNA测序的方法检测2686例感音神经性耳聋患者GJB2、SLC26A4基因致病性突变情况,以Sennaroglu分类为标准统计以上患者内耳CT表型情况,分析GJB2、SLC26A4基因型与CT表型之间的关系。结果 1、2686例患者中共检出GJB2基因致病性突变429例(双等位基因纯合突变220例、复合杂合突变207例、单等位基因显性突变2例),共检出SLC26A4基因致病性突变596例(双等位基因纯合突变169例、复合杂合突变427例)。2、2686例患者中内耳畸形873例(Mondini畸形371例、单纯大前庭水管338例、其它164例);内耳CT正常1813例。3、GJB2基因致病性突变99.30%(426/429)在内耳CT正常组中检出,SLC26A4基因致病性突变100%(596/596)在前庭水管扩大相关内耳畸形中检出。结论 GJB2基因致病性突变与内耳正常CT表型密切相关;SLC26A4基因致病性突变与前庭水管扩大相关内耳畸形密切相关。

共培养系统下骨髓间充质干细胞分化为颌下腺腺泡细胞的实验研究

目的研究使用共培养系统将骨髓间充质干细胞分化为有分泌功能的颌下腺腺泡细胞的可行性。方法分离成年SD大鼠骨髓间充质干细胞于体外培养、纯化和鉴定,同时分离新生SD大鼠的颌下腺细胞于体外培养、纯化和鉴定,取颌下腺腺泡细胞第二代和间充质干细胞第一代置于共培养系统诱导干细胞定向分化。使用免疫细胞化学法分析骨髓间充质干细胞是否表达淀粉酶抗体。结果纯化后的颌下腺腺泡细胞呈铺路石样形态,原代至第5代培养基及细胞内均可检测到淀粉酶表达;体外培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,呈束状、漩涡状排列,可成功诱导成脂肪细胞,油红-O染色显示含有脂滴;共培养后的骨髓间充质干细胞表达淀粉酶抗体,约30%的骨髓间充质干细胞在共培养1周后转化为腺泡细胞,约50%的骨髓间充质干细胞在共培养2周后转化为腺泡细胞。结论成功构建大鼠颌下腺腺泡细胞和骨髓间充质干细胞的体外培养体系,并证明大鼠骨髓间充质干细胞具有转化为腺泡细胞的能力,因此骨髓间充质干细胞将有望应用于涎腺组织工程。

TGF-β1基因转染骨髓基质干细胞促进BMP-2活性多肽大鼠体内异位成骨

目的评价转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染骨髓基质干细胞(BMSC)能否增强骨形态发生蛋白(BMP)活性多肽P24在大鼠体内异位成骨的能力。方法通过新型非病毒基因载体K(16)GRGDSPC将TGF-β1真核表达载体质粒pcDNA3-TGF-β1导入BMSC,筛选出阳性克隆并扩大培养。将稳定转基因细胞与胶原海绵复合,同时加入BMP-2活性肽P24,构建转基因细胞/胶原海绵/P24复合体。将该复合体植入大鼠竖脊肌浅层肌袋,3、5、8周时对植入局部行CT成像,组织碱性磷酸酶(ALP)活性检测及组织切片的苏木精-伊红染色,观察复合体异位成骨的能力。结果免疫组化SABC法检测转染后BMSC中TGF-β1的表达,见实验组呈阳性染色。3、5、8周时CT成像两组均可见骨组织形成,且呈时间相关性,实验组CT值分别为(254±20)、(331±34)、(477±37)Hu,均明显高于同期对照组的CT值[分别为(237±17)、(298±31)、(433±45)Hu](均P<0.05);植入局部ALP活性测定实验组分别为(57.78±0.64)、(65.70±0.59)、(71.83±0.67)U/L,亦高于对照组[分别为(55.46±0.55)、(63.27±0.53)、(70.32±0.63)U/L];苏木精-伊红染色可见实验组编织骨的数量明显多于对照组。结论K(16)GRGDSPC能成功介导TGF-β1基因转染BMSC并有效表达;TGF-β1基因转染BMSC可增强BMP-2活性肽P24的异位成骨能力。

Math1基因内耳导入后噪声性聋豚鼠听功能改变观察

目的观察Math1基因内耳导入对噪声性聋豚鼠听功能的影响,探讨Math1基因过表达对噪声损伤耳蜗的生物学效应,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法经脉冲噪声致聋的豚鼠45只(各频率ABR阈值均≥95dB SPL),雌雄不限,实验开始时体重250～300g。随机分为3组:Ad-Math1-EGFP组(30只);Ad-EGFP组(5只);空白组(10只)。各组豚鼠在基因转导后4周、8周分别测试双耳ABR。测试完毕后处死动物,观察听泡及耳蜗无炎性病变者记录听阈结果。结果Math1导入后4周,导入耳各频率ABR阈值低于对照耳(右耳),也低于Ad-EGFP组及空白组,平均达到85dB SPL。Math1导入后8周,导入耳各频率ABR阈值低于对照耳(右耳),也低于Ad-EGFP组及空白组,与4周时比较,进一步好转,平均达到75dB SPL。结论Math1基因内耳导入可使噪声导致全聋的豚鼠听功能部分恢复,为噪声性聋的治疗打开了新的思路和手段。

纳米材料细菌纤维素对大鼠皮肤创伤的促愈作用

目的:通过动物实验观察细菌纤维素作为创伤敷料的可能性,提高其应用价值。方法:实验于2002-06/12在解放军第二军医大学动物实验中心完成。①成年健康SD大鼠30只,用自制创伤仪于大鼠背部脊柱两侧各制造2.0cm×2.0cm大小的皮肤伤口,深及真皮层,造成皮肤缺损,两个创面之间间隔1cm。以细菌纤维素膜治疗(治疗组),油纱布为对照(对照组)。②观察M12菌体及液体培养特征;扫描电镜观察细菌纤维素膜表面孔径。③于手术后4,7,14,21,28d观察创面愈合情况;并于各时间点随机抽取6只大鼠过量麻药处死进行光镜组织学观察。④伤口愈合率(%)=犤(原有创面总面积-观察时创面面积)/原有创面总面积犦×100。结果:30只大鼠全部进入结果分析。①M12菌体及液体培养特征:透射电镜下可清楚地看到M12菌细胞的形状为椭圆至杆状,挺直或稍弯曲,无鞭毛,不运动。M12静态培养,在液面产生纤维素液膜,经预处理后呈乳白色半透明胶状液膜,外表均匀光滑,质地柔韧。②细菌纤维素膜表面孔径:该膜表面孔径为20～50μm。③两组大鼠不同时间点宏观观察结果:所有实验动物无死亡。觅食饮水等活动正常,两组均未出现创面感染。④两组大鼠伤后不同时间伤口愈合率:治疗组7,14,21,28d伤口创面愈合率较对照组显著提高犤(16.17±2.14)%比(11.83±1.94)%,P<0.05;(70.54±6.35)%比(55.28±6.63)%,(92.60±5.62)%比(78.73±6.24)%,(100.00±0.00)%比(93.67±6.33)%,P<0.01犦。⑤组织学观察结果:治疗组肉芽组织层形成较厚,成纤维细胞和血管内皮细胞增生活跃,胶原纤维束增多,真皮层内小血管增生明显。对照组肉芽组织层较薄,成纤维细胞和血管内皮细胞增生不活跃,胶原纤维含量较治疗组少,小血管数量少。结论:①细菌纤维素膜对皮肤创伤性损伤具有促进愈合和抗感染的作用。②为新生的毛细血管和成纤维细胞提供了合适的三维支架,可允许成纤维细胞和毛细血管逐渐长入。③有可能成为一种临时皮肤代用品和有应用潜力的生物敷料。

人外周血单核细胞3种不同转染方法的比较

目的采用3种不同方法转染原代人外周血单核细胞,以寻找一种简便、高效的单核细胞转染方法。方法采用人淋巴细胞分离液从健康人外周血中分离出单个核细胞,锥虫蓝拒染法检测细胞存活率。单个核细胞在孔板内培养2 h后吸弃悬浮的淋巴细胞,获得贴壁的单核细胞。分别采用Lipofectamine 2000介导载体质粒(PEGF-N1),慢病毒(NC-GFP-LV)及腺病毒(Adv-GFP)3种方法转染单核细胞,48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,并收集细胞上流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例。结果通过人淋巴细胞分离液分离的单个核细胞的活细胞率>95%,获得的单核细胞数量多,贴壁牢,形态均一。转染48 h后,Lipofectamine 2000介导载体质粒及慢病毒转染的单核细胞无绿色荧光,流式细胞仪检测GFP阳性细胞均<1%,腺病毒转染的单核细胞可见较强绿色荧光,GFP阳性细胞约占10%。结论腺病毒,而不是Lipofectamine 2000或慢病毒,能有效地将外源基因导入单核细胞内表达。

副溶血性弧菌分型研究进展

副溶血性弧菌(vibrio parahaemolyticus,VP)是一种革兰氏阴性嗜盐性海洋细菌,常导致食物中毒和急性腹泻,本文从传统分型和基因分型角度介绍其分型研究进展。随着分子生物学的发展,各种分型研究,如血清学分型、噬菌体分型、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型、限制性片段长度多态性(RFLP)分型、随机引物扩增DNA多态性(RAPD)分型、核糖分型、肠道细菌重复基因间共有序列PCR(ERIC-PCR)分型等为VP的准确溯源提供了科学依据,可有效预防和控制该菌引起的腹泻及食物中毒事件,对研究VP分子流行病学特征具有重要意义。

染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用综述

染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)是一项新兴的染色体分析技术。它能够明确核型分析异常片段的来源与性质,有效诊断核型分析无法辨识的染色体微缺失与微重复,显著提高了胎儿染色体异常的检测成功率和诊断率。与染色体核型分析相比,CMA分辨率更好、自动化程度更高、检测周期更快。但同时,临床意义不明确的拷贝数变异(variant of uncertain significance,VOUS)的检出给CMA的遗传咨询带来挑战。本文对CMA在产前诊断的应用进行综述。

耳聋基因芯片技术在耳聋病因诊断中的应用

目的使用耳聋基因芯片技术对耳科门诊耳聋患者进行病因诊断。方法收集26例明确为感音神经性听力下降的聋病患者,使用基因芯片检测试剂盒进行检测。结果 26例患者中先天性耳聋者10例,检出率为40.00%;成年感音神经性耳聋者13例,检出率为23.08%;突发性耳聋者3例,检出率为66.67%。结论遗传性耳聋基因检测试剂盒对于明确聋病患者致聋原因有一定的帮助,具有临床推广价值。

CXCR4基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的探讨构建大鼠趋化因子受体4(CXCR4)基因过表达慢病毒载体的技术方法并检测其体外表达目的基因的水平。方法设计CXCR4基因引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增CXCR4基因片段;用AgeⅠ酶切GV208载体;通过连接酶将CXCR4基因片段连接至线性化的GV208载体上;运用PCR方法鉴定阳性克隆的CXCR4-GV208载体;按GV208慢病毒包装试剂盒说明书包装慢病毒并运用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法行滴度检测;然后用重组慢病毒转染293T细胞(人胚肾细胞),观察GFP表达。结果通过PCR成功地扩增了CXCR4基因片段并连接到了GV208病毒载体上,通过PCR及DNA测序鉴定,证明CXCR4-GV208质粒构建正确,重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达。包装过表达慢病毒并测其浓缩滴度为2.0×108 TU/mL。结论成功构建CXCR4-GV208慢病毒载体,为CXCR4基因的后期研究提供了实验基础。

DC-SIGN真核表达载体的构建及其稳定转染BHK21细胞系的建立

目的构建DC-SIGN分子真核表达载体,获得可稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。方法以pUNO-hDC-SIGN1Aa质粒为模板,通过PCR方法扩增人DC-SIGN基因,经过NotI和BamHI双酶切之后,将其克隆入真核表达载体pIRES-neo,构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,以NotI和BamHI双酶切以及测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒以Lipo-fectamineTM2000转染到BHK21细胞,通过G418及有限稀释法进行阳性克隆的筛选,建立稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western blotting及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达。结果双酶切鉴定证明DC-SIGN基因已经成功克隆入真核表达载体pIRES-neo中,测序结果表明DC-SIGN基因与原序列一致。pIRES-neo-DC-SIGN转染BHK21细胞后,获得了稳定表达DC-SIGN分子的细胞系。流式细胞仪检测结果显示,阳性克隆中DC-SIGN分子的表达率为85.42%。免疫荧光结果显示,DC-SIGN分子主要表达于细胞膜表面。Western blotting能检测到DC-SIGN蛋白表达的特异条带。结论成功构建了稳定、高效表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。

人成纤维细胞生长因子7的基因克隆和蛋白鉴定

目的:构建人成纤维细胞生长因子7的重组原核表达质粒pGEX-4T-3-FGF7,并诱导其基因在大肠杆菌DH5α中大量表达,纯化蛋白并检验生物学活性。方法:实验于2006-12在本实验室完成。采用逆转录-聚合酶链反应技术,从人皮肤成纤维细胞内扩增编码人成纤维细胞生长因子7的cDNA序列,以DNA重组技术将获得的目的基因片段连接至原核表达载体pGEX-4T-3上,经抗生素筛选挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序。同时应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹方法对其表达产物进行特异性鉴定。超滤纯化蛋白后以四甲基偶氮唑盐法测定其在不同浓度作用下对人表皮角化细胞系生长的影响。结果:克隆出的成纤维细胞生长因子7基因的cDNA包括翻译起始密码子、编码序列和终止密码子等部分,含有成纤维细胞生长因子7基因的cDNA的表达质粒pGEX-4T-3-hFGF7在DH5α细菌体内能够表达,并且随着诱导时间的延长,成纤维细胞生长因子7基因的表达量增加,重组人成纤维细胞生长因子7蛋白主要存在于包涵体中。在所测浓度范围内该蛋白可以剂量依赖模式促进人表皮角化细胞系细胞在体外分裂增殖。结论:人成纤维细胞生长因子7基因可以在原核细胞中获得表达并具有促角质细胞增殖的生物活性,为深入研究该蛋白在皮肤创伤愈合中的具体作用奠定了基础。

眼源性前庭诱发肌源性电位

眼性前庭诱发肌源性电位(ocular vestibular evoked myogenic potential,oVEMP)是起源于椭圆囊的能够客观反映前庭-眼反射通路完整性一种无创电生理检查,是一项新的前庭功能检查技术,与眼震电图和颈性前庭诱发肌源性电位用于眩晕相关疾病诊断及鉴别诊断,全面评价前庭系统的功能状态。

Wistar大鼠c-ski基因部分序列的克隆、测序及实时荧光定量PCR的建立

目的测定Wistar大鼠c-ski基因部分序列,并应用于检测大鼠c-ski基因表达的实时荧光定量PCR的建立。方法提取培养的Wistar大鼠皮肤成纤维细胞总RNA,通过RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到PMD-18T载体上并测序。根据获得的c-ski基因部分序列设计实时荧光定量PCR引物,建立SYBRgreen定量PCR检测方法,并检测培养的大鼠皮肤成纤维细胞c-skimRNA表达水平。结果获得的Wistar大鼠c-ski基因cDNA序列长561bp,为未曾报道的新序列,其与人、小鼠具有较高的同源性,Gen-Bank收录(收入号DQ409171)。建立的SYBRgreen定量PCR检测标准品在103～109拷贝范围内的相关系数为0.99149。体外培养的Wistar大鼠皮肤成纤维细胞样品中c-skimRNA水平为(1.02±0.18)×106拷贝/μl。结论新获得了Wistar大鼠c-ski基因部分序列,该序列可用于实时荧光定量PCR的建立。

pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒的构建及其在活细胞内的相互作用

目的构建pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察Olig2与Id4的相互作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增Olig2和Id4基因,分别定向克隆到pBiFC-VN173和pBiFC-VC155载体中,获得pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒。对此2种质粒进行酶切鉴定、测序;用脂质体方法共转染pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4质粒到人结肠癌细胞系SW-1116细胞中,在荧光显微镜下观察Olig2与Id4之间的相互作用。结果通过酶切鉴定和测序表明成功构建了pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒;该质粒能够有效地共同转染到靶细胞,Olig2和Id4在靶细胞中能够高效表达,并可以相互结合出现BiFC荧光信号,且该信号主要分布于胞质中。结论成功构建了用于BiFC技术的真核表达载体,并在活细胞内检测到Olig2和Id4分子的相互结合。

IKVAV多肽自组装纳米纤维促进PC12细胞的黏附性能

目的:细胞黏附性能是评价神经组织工程基质材料的重要指标,拟对包含神经活性多肽片断的IKVAV多肽两亲性分子在体外进行自组装,并且检测其对PC12细胞黏附的影响。方法:实验于2005-12/2006-03在华中科技大学附属协和医院骨科实验室完成。IKVAV多肽两亲性分子委托上海波泰生物科技公司合成,并用高效液相色谱仪和质谱仪进行纯化和分析。在IKVAV多肽两亲性分子中加入稀盐酸降低pH值引发其自组装,用不同浓度的IKVAV自组装材料包被培养板,培养PC12细胞,检测IKVAV对PC12细胞黏附的影响。结果:①当IKVAV自组装材料的密度为0.58～15.0μg/cm2时,能明显增强PC12细胞黏附,而且在一定的范围内随密度增加PC12细胞的黏附率升高。②在1h和3h各IKVAV密度组的细胞黏附率之间差异无显著性。结论:IKVAV能够促进PC12细胞黏附,而且有一定的量效关系。同时,IKVAV促进PC12细胞黏附的作用迅速、稳定。