SARS冠状病毒M基因膜内区的克隆、表达与鉴定

目的对SARS冠状病毒M蛋白膜内部分(Mc蛋白)的基因(Mc区)进行克隆、表达及鉴定。方法采用PCR技术从SARS-CoV GD322株M基因全长片段上扩增得到Mc区,克隆至pGEM-T载体。利用引物上的EcoRI/XhoI酶切位点切下Mc区插入至pET-32a(+)表达载体,转化原核表达系统BL21,表达His-融合蛋白,利用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定。结果扩增的Mc区长度为360bp,重组子经PCR,双酶切和测序鉴定,获得pET-32a(+)/Mc原核表达菌株并可进行高效表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot验证为相对分子质量约43000的融合蛋白,与预期理论值相符。结论实现了Mc蛋白的高效表达,为进一步研究SARS冠状病毒Mc蛋白的生物学作用奠定了基础。

Epstein-Barr病毒胸苷激酶(TK)基因表达质粒的构建

目的 :构建高效表达 EBVTK的重组克隆体系。方法 :以 p UC8X为模板 ,5’- CTGAATTCATG-GCTGGATTTCC- 3’及 5’CAACTGCAGCCTAGTCCCGATT- 3’为引物 ,用 PCR技术扩增出 EBV tk基因的 DNA片段。Eco R I/ Pst I双酶切 PCR产物和载体 p BV2 2 0 ,T4连接酶使目的基因 tk定向克隆至选定质粒 p BV2 2 0中。结果 :重组质粒 p BV2 2 0 - tk经 Eco R I/ Pst I双酶切后得两条电泳带分别位于 1.8kb、3.6 kb处 ;以 p BV2 2 0 - tk为模板 ,两引物同上进行 PCR扩增 ,产物电泳带于 1.8kb处。结论 :目的基因 tk已定向克隆至质粒 p BV2 2 0中。

我国首例输入性D_9基因型麻疹病毒的分离和鉴定

目的分离并鉴定我国首例输入性D9基因型麻疹病毒。方法使用Vero/SLAM细胞(非洲绿猴肾细胞/淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞)分离病毒,使用逆转录-聚合酶链反应扩增出编码核蛋白羧基末端450个核苷酸片段,通过对扩增产物进行核苷酸序列测定和分析,构建基因亲缘性关系树,进行遗传距离分析。结果四川省D9基因型麻疹病毒分离株MVi/Sichuan.CHN/07.09/1和世界卫生组织D9基因型代表株Victoria.AUS(维多利亚?澳大利亚)/12.99在基因亲缘性关系树上同属一个分支,核苷酸同源性为96.9%;和2008年流行于泰国和荷兰的D9基因型麻疹野病毒的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8%～100%和99.3%～100%;和中国大陆目前所使用的麻疹疫苗株沪191相比对,其核苷酸和氨基酸同源性分别为92.3%和90.7%;和中国目前流行的麻疹病毒绝对优势本土基因型H1基因型代表株相比对,其核苷酸和氨基酸同源性分别为90.8%和92.1%。结论输入中国四川省的麻疹病毒株为D9基因型。