PCR检测与细菌培养方法在细菌性痢疾监测中的应用比较

目的通过与PCR检测比较,确定细菌培养方法对细菌性痢疾疾病负担的低估程度。方法从2002年细菌性痢疾监测研究获得的10105份腹泻标本中随机选取337份,采用针对ipa H基因的PCR方法检测其志贺菌感染,并同传统细菌培养方法进行比较。结果337份腹泻标本中检测到ipa H基因212份,检出率为62.9%;而粪便培养阳性为39份,检出率为11.6%(P<0.001)。Logistic回归分析显示影响PCR检出的因素依次为细菌培养结果(OR=15.5;95%CI:2.0-119.0),具有发热症状(OR=2.8;95%CI:1.2-6.2),菌痢流行季节的腹泻(OR=2.4;95%CI:1.4-4.3)及女性病例(OR=1.8;95%CI:1.1-3.0)。结论与PCR检测相比,传统细菌培养方法使得菌痢的发病率在相当大的程度上被低估。

安徽省志贺菌属菌群分布及耐药性研究

目的了解合肥省志贺菌属的分布及耐药情况,以指导临床合理用药。方法采用国际标准平皿琼脂对倍稀释法测定合肥省35所医院2005年9月份收集的91株志贺菌属对多种抗菌药物的敏感性,用生化和血清学方法鉴定血清群。结果91株志贺菌属中,有弗氏志贺菌57株、宋内志贺菌31株、鲍氏志贺菌3株;91株志贺菌属对头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率,明显低于其他头孢类抗菌药物,对碳青酶烯类敏感率达100%,对氟喹诺酮类环丙沙星及帕珠沙星的耐药率分别是27.47%、32.97%。结论合肥省志贺菌属对喹诺酮类和三代头孢类抗菌药物有一定耐药性,应加强耐药性监测和防治。

痢疾杆菌全基因组序列及基因组岛的分析

福氏 2a志贺菌 (Shigellaflexneriserotype 2a)是引起人类细菌性痢疾的主要病原体。本文在国际上首次完成了福氏 2a志贺菌 30 1株 (Sf30 1) (我国细菌性痢疾的优势流行株 )的全基因组核苷酸序列测定和初步分析。该基因组包括一条由 4 6 0 72 0 3个碱基对 (bp)组成的环状染色体和一个含 2 2 16 18bp的侵袭性大质粒pCP30 1以及另外两个小质粒。通过将Sf30 1的染色体序列与其亲源关系相近的非致病性大肠杆菌K - 12菌株MG16 5 5进行比较基因组学研究 ,发现Sf30 1的染色体上有 5 72Kb特异性序列 ,并形成了 32 0个长度大于 5 0bp的“痢疾岛” (Shigella island ,SIs) ,其中大于 1Kb的共计 131个。这些岛共包含 5 19个开放读码框架 (OpenReadingFrames,ORFs) ,多数SIs的一侧或两侧均伴有插入序列元件、转座子或者tRNAs。G +C含量及密码子使用频率等分析显示出部分SIs的外源性。通过结构及ORF编码产物功能的分析 ,鉴别出 9个可能与痢疾杆菌致病性有关的“毒力岛” ,其中

志贺菌主动外排泵acrAB-tolC及调控基因marOR突变与耐药的关系

目的:研究志贺菌的耐药状况,检测临床分离志贺菌主动外排泵acrAB-tolC基因及调控基因marOR的突变情况,并探讨其与耐药性的关系。方法:对159株临床分离的志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、复方新诺明6种药物的药敏试验和有机溶剂耐受试验,对其acrAB-tolC基因和marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增,并进行限制性内切酶酶切与单链构象多态性(SSCP)分析。结果:159株临床分离的志贺菌属细菌筛选出4株敏感株、18株耐单药株和137株耐多药株,耐多药率为86.2%(137/159);159株中有122株对有机溶剂耐受,耐受率为76.7%(122/159);159株均扩增出acrAB-tolC基因和marOR基因,未发现基因缺失株;单链构象多态性分析,155株耐药菌株中,marOR基因的突变率为17.4%,acrA基因的突变率为5.8%,acrB基因的突变率为3.9%,tolC基因的突变率为2.6%;4株敏感株未发现marOR、acrA、acrB和tolC基因突变。结论:临床分离的志贺菌耐多药率和有机溶剂耐受率均较高,且存在较高的marOR基因突变率。

杭州地区细菌性痢疾菌谱分布及耐药性调查

目的调查1996-2005年杭州地区细菌性痢疾菌谱分布及其耐药情况,为临床合理用药提供依据。方法分析1 332株志贺菌属的菌型及对18种抗菌药物的耐药情况。结果检出弗氏志贺菌最高为1 235株,宋内志贺菌次之为97株;志贺菌属对氨苄西林、复方新诺明、氯霉素、诺氟沙星耐药严重,氨基糖苷类抗菌药物及喹诺酮类抗菌药物的耐药率较低,出现对第三代头孢类抗菌药物耐药及多重耐药现象,多重耐药的比例从1996年的6.0%上升到2005年的65.0%(P<0.01,χ2=6.14)。结论弗氏志贺菌是杭州地区优势菌,为减少耐药及多重耐药现象,临床治疗宜合理使用抗菌药物。

江苏省南通市涂阳肺结核患者耐药率及耐药谱分析

目的对南通市涂阳肺结核患者进行5年的耐药性监测，对耐药率和耐药谱进行分析，为制定南通市结核病防控策略提供科学依据。方法2009年10月1日至2014年6月30日，南通市7家结核病定点医疗机构共确诊18256例肺结核患者，对其中2776例痰涂片阳性的初、复治患者进行分枝杆菌培养、菌种鉴定，对培养成功的1893株结核分枝杆菌菌株采用比例法对异烟肼（H）、利福平（R）、乙胺丁醇（E）、链霉素（S）、氧氟沙星（Ofx）和卡那霉素（Kin）等6种抗结核药物进行药物敏感性试验（简称“药敏试验”）。结果南通市结核分枝杆菌的总耐药率、单耐药率、多耐药率、耐多药率分别为21．34％（404／1893）、5．86％（111／1893）、3．17％（60／1893）、12．31％（233／1893）；复治患者的总耐药率、单耐药率、多耐药率、耐多药率分别为45．74％（252／551）、8．17％（45／551）、4．54％（25／551）、33．03％（182／551），均高于初治患者[11．33％（152／1342）、4．92％（66／1342）、2．61％（35／1342）、3．80％（51／1342）I，矿值和P值分别为：总耐药率（X^2=275．50，P=O．000）、单耐药率（X^2=7．47，P=0．006）、多耐药率（X^2=4．74，P=0．030）、耐多药率（zX^2=309．22，P=0．000），差异均有统计学意义。对404例耐药患者进行上述6种药物的药敏试验，共有29种耐药谱组合。其中单耐药有6种组合，对单一耐S构成比最高，为40．55％（45／111）；其次是单一耐H，占33．33％（37／111）。多耐药有14种组合，以耐H＋s构成比最高（41．67％，25／60）；其次是耐R＋S（13．33％，8／60）。耐多药有10种组合，以耐H＋R＋S构成比最高（35．62％，83／233）；其次是耐H＋R（34．76％，81／233）。初、复治涂阳患者中均有耐二线药物的组合；对S耐药的初、复治患者中，顺位分别是第2位（86例）和第3位（128例）。结论南通市耐多药结核病疫情防控形势不容乐观，应进一步强化以DOTS策略为基础的现代结核病控制策略，提高结核病患者诊断、治疗和管理质量，减少复治患者的产生，从而减少耐多药结核病患者的出现。

黄连素、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用

比较了黄连素二硫酸盐 (BDH)、溴化乙锭 (EB)、十二烷基硫酸钠 (SDS)不同浓度、不同处理时间和方式对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用。结果表明 :BDH对痢疾杆菌耐药质粒的消除作用较小 ;EB对痢疾杆菌的耐药质粒有较好的消除作用 ,以连续培育法处理 1 2 0 h,消除率可达 85% ;SDS对痢疾杆菌的耐药质粒有一定的消除作用 ,以高温高浓度双重处理交替培养 ,消除率可达 2 7%。

痢疾杆菌耐药性质粒的转移与扩散的研究

为探讨痢疾杆菌耐药性的转移及扩散方式 ,作者在检测痢疾杆菌的耐药状况及质粒携带情况的基础上 ,进行了耐药质粒的接合传递和质粒 DNA的转化试验。结果 90 .2 4%的痢疾杆菌具有多重耐药性 ,83.5 4%携带有质粒 DNA条带。弗氏志贺氏菌的接合传递阳性率为 6 0 .78% ,索氏志贺氏菌为 16 .7% ,弗氏志贺氏菌的 R质粒传递能力强于索氏志贺氏菌 ,接合传递过程中存在耐药标记的分离现象 ;质粒 DNA转化率为 2 7.5 % ,弗氏志贺氏菌与索氏志贺氏菌的转化率差异无显著意义。上述结果说明痢疾杆菌的耐药性主要通过接合传递扩散 ,质粒 DNA的转化在痢疾杆菌耐药性扩散中也具有重要意义。

北京市2009—2011年痢疾病原菌菌型分布和流行病学特征分析

目的分析2009—2011年北京地区志贺菌的菌型分布及流行病学特征。方法收集2009—2011年痢疾监测中分离到的志贺菌788株进行血清分型。结果 788株志贺菌中宋内志贺菌597株(占75.76%),福氏志贺菌188株(占23.86%)。检出高峰在8、9月份,年龄段以21～30岁为主。结论近三年北京市志贺菌流行菌型为福氏志贺菌和宋内志贺菌,其中优势菌型为宋内志贺菌。今后痢疾防控应以夏秋季为主。

70株志贺菌属血清分型及耐药分析

目的分析医院细菌性痢疾的流行菌株类型及耐药特点。方法对医院肠道门诊腹泻患者的粪便标本进行细菌分离培养、鉴定和血清分型,并以K-B琼脂法进行药敏实验。结果在检出的70株志贺菌属中,弗氏志贺菌37株、宋内志贺菌33株,未分离出志贺菌属的其他型别;70例菌株对传统抗菌药物中的四环素、复方新诺明、氨苄西林、利福平、萘啶酸的耐药率均>62%,对喹诺酮类的常用药诺氟沙星耐药率较低为12.8%,而头孢类的耐药率<10%。结论医院细菌性痢疾流行株主要是弗氏志贺菌和宋内志贺菌,多重耐药率较高,达到77.1%,临床治疗可首选头孢菌素类药物,庆大霉素和诺氟沙星次之。

河南省痢疾感染特点及病原特性研究

〔目的〕了解志贺痢疾杆菌流行菌型变异及其生物学特性 ;〔方法〕对河南省监测点 2 0 0 1、2 0 0 2年分离的 2 14株痢疾杆菌应用血清学、生化学、药物敏感等试验进行系统的鉴定 ;〔结果〕 2 14株痢疾杆菌优势流行菌型由原来的福氏志贺 2a正逐渐向福氏 4、4c、1a、5b转变 ;2 14株菌均对头孢唑啉、诺氟沙星、多粘菌素B 10 0 %敏感 ,对头孢噻肟、头孢他啶、呋喃妥因、环丙沙星敏感率在 97%以上 ;对四环素、萘啶酸耐药高达 92 %以上。〔结论〕农村近两年痢疾感染的优势菌型仍为福氏志贺菌 ,福氏 1a、4c、4及 5b菌型的感染率呈逐年上升的趋势[2 - 3] ;药物敏感测试结果为临床合理用药提供了确切依据。

151株志贺菌菌群分布及耐药性分析

目的研究近年来肠道门诊腹泻患者志贺菌菌群分布及其耐药特点,为细菌性痢疾临床治疗和预防控制提供依据。方法采用志贺菌及沙门菌琼脂培养基培养,可疑菌株经VITEK-32细菌鉴定仪及血清凝集鉴定到群,K-B法检测抗菌药物的耐药性。多重耐药菌用纸片确认试验检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs),三维试验检测AmpCβ-内酰胺酶(AmpC酶)。结果 151株志贺菌中主要为宋内志贺菌(85株,占56.3%)和福氏志贺菌(64株,占42.4%),且感染患者主要集中在0～10岁年龄段,占总感染率的72.2%(109/151)。药敏结果显示,福氏志贺菌和宋内志贺菌对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林和复方磺胺甲噁唑的耐药率较高,均>50%,对三代头孢及四代头孢的耐药率均在35%以下;福氏志贺菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为29.6%和21.8%,未发现宋内志贺菌耐药者,且两者对哌拉西林/三唑巴坦和亚胺培南全部敏感。31株多重耐药菌经纸片确认试验均为ESBLs阳性菌株,但未发现AmpC酶阳性者。结论我院肠道门诊腹泻患者以感染宋内志贺菌和福氏志贺菌的婴幼儿为主,两种志贺菌对部分种类的抗菌药物药敏性差别较大,临床医师应根据菌群鉴定及药物敏感试验结果合理选择抗菌药物。

福氏志贺菌5a型M90T株GAPDH蛋白多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备高效的福氏志贺菌5a M90T3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的多克隆抗体,并对其特异性进行评价。方法提取M90T的全基因组,采用PCR法扩增M90T中的基因gapA克隆到原核表达载体pET-24中,重组质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,条件优化后纯化GAPDH-His融合蛋白。以纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体。Western blot法、ELISA鉴定获得的抗血清。结果成功构建了原核表达载体pET24a-gapA,通过一系列诱导条件的优化,确定可溶性条件为30℃、1 mmol/L IPTG诱导2 h。用纯化的融合蛋白GAPDH-His作为抗原免疫小鼠制备多克隆抗体,Western blot法、ELISA证明多克隆抗体制备成功。结论成功制备了福氏志贺菌5a M90T特异性的小鼠多克隆抗体。

分子信标PCR检测志贺菌ipaH基因

目的用分子信标探针PCR快速检测志贺菌属(Shigella)。方法根据GenBank上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列,设计引物和分子信标探针,以4种细菌进行对照,进行特异性和灵敏度分析,建立Shigella的实时PCR技术快速检测,应用于食物中毒和食品检测。结果检测20个样本,Shigella呈阳性,其它呈阴性,时间约2h。结论Shigella分子信标探针技术具有快速、灵敏度高、特异性强等特点,可用于Shigella食物中毒快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的早期、准确诊断提供新的检测手段。

志贺氏菌的RAPD鉴定研究

目的 :建立水或食品中志贺氏菌的快速鉴定方法。方法 :首先采用特异性PCR技术对细菌进行初步检测 ,以确定其是否为志贺氏菌 ;然后采用随机引物扩增DNA多态性 (RAPD)技术对志贺氏菌再进行鉴定。结果 :志贺氏菌特异性引物 (ipaH引物 )扩增阳性的细菌经RAPD技术进行基因水平的分型 ,发现相同种的志贺氏菌株产生了基本相同的条带模式 ,不同种的菌株 ,甚至同一种菌的不同型间的条带模式也存在一定差异 ,结果经实际分离样品的验证。结论

某院2008～2012年儿科血培养病原菌变迁及耐药谱分析

目的了解近年来儿童血流性感染的病原体构成变化和药敏情况,以指导临床治疗。方法回顾性分析中山大学附属第一医院2008年1月至2012年12月从儿童血液标本中培养出的病原体资料,用WHONET5.6软件分析病原体的构成情况及其药敏情况。结果共培养出病原菌312株,革兰阳性菌122株;革兰阴性菌190株,其中肺炎克雷伯菌比例最大(25.96%)。所有血培养阳性标本主要来自儿科血液病区患者,占51.60%。革兰阳性菌主要对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺敏感,而革兰阴性菌对碳青霉烯类抗菌药物敏感,对常用抗菌药物如氨苄西林、头孢菌素等存在广泛的耐药。结论该院儿科血流性感染的病原体构成以革兰阴性菌占优势,致病细菌对青霉素类及头孢类抗菌药物存在较高耐药性,临床上应合理应用抗菌药物,根据药敏结果选择药物,减少耐药的出现。

MALDI-TOF-MS鉴定宋内志贺菌的临床应用

目的建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定宋内志贺菌的质谱数据库,实现对临床分离宋内志贺菌的快速鉴定。方法建立经提取法处理后鉴定宋内志贺菌的质谱数据库。在分别使用直接涂抹法和提取法处理后对200株宋内志贺菌野生株进行鉴定验证;同时针对宋内志贺菌的不同菌相、不同激光强度和不同样本保存时间分别进行MALDI-TOF-MS鉴定。再选取100株大肠埃希菌,进行MALDI-TOF-MS鉴定,以确定新建数据库的特异性。结果宋内志贺菌经提取法处理后的鉴定符合率为100%,经直接涂抹法处理后的鉴定符合率为71.5%。宋内志贺菌不同菌相和不同激光强度的鉴定结果差异无统计学意义(P>0.05);而样本不同保存时间鉴定结果差异有统计学意义(P<0.05)。使用新数据库后,大肠埃希菌鉴定符合率为96.0%。结论经提取法处理后应用MALDI-TOF-MS鉴定宋内志贺菌建立的质谱数据库,能快速、准确鉴定宋内志贺菌到种水平,满足腹泻病原菌临床分离株的快速诊断。

1831株宋内志贺菌耐药性调查及其产ESBLs的研究

目的了解分离自腹泻患者的1831株宋内志贺菌的流行趋势及耐药情况,探讨宋内志贺菌多重耐药机制。方法采用志贺菌及沙门菌琼脂培养基培养及K-B法检测14种抗生素的耐药率。多重耐药菌用纸片确认试验检测产超广谱β内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs),改良三维试验检测ESBLs和AmpCβ内酰胺酶(AmpC β-lactamase,AmpC酶)。结果1831株宋内志贺菌感染腹泻患者中,男女比例为1.25∶1。高发季节为7～9月。1～20岁发病人数占总发病人数的71.0%。宋内志贺菌对复方磺胺甲噁唑、氨苄西林和头孢曲松的耐药率较高,分别达87.7%、23.0%和9.5%,且增高趋势明显;对氟喹诺酮类,头孢吡肟、头孢美唑、氯霉素、磷霉素和庆大霉素的耐药率较低,明显低于头孢曲松、头孢噻肟(P<0.05)。43株多重耐药菌均为ESBLs阳性株,未发现产AmpC酶株。结论在北京地区,宋内志贺菌感染腹泻患者发病年龄以青少年为主。其在志贺菌属感染的比例中有增高的趋势,对头孢曲松、头孢噻肟、复方磺胺甲噁唑、氨苄西林的耐药率较高且有上升趋势。宋内志贺菌耐头孢菌素者以产ESBLs为主。