含产气荚膜梭菌肠毒素基因重组质粒pET-28a-CPE的构建和表达

目的构建含全长产气荚膜梭菌肠毒素(CPE)基因的重组表达质粒pET-28a-CPE并进行原核表达。方法培养并提取表达肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615的基因组DNA,PCR扩增出全长CPE基因片段并连接入pET-28a载体质粒中,构建重组原核表达质粒pET-28a-CPE,进行酶切及测序鉴定,并转化入感受态大肠杆菌(E.coli)BL21中,用IPTG诱导CPE表达。结果复苏、培养成功产肠毒素的产气荚膜梭菌标准菌株64615,成功构建了表达质粒pET-28a-CPE,经酶切及测序鉴定结果与设计的完全相符,成功用E.coli BL21进行了原核表达,目的蛋白CPE占总表达蛋白45.37%。结论本实验成功构建并表达了含CPE的重组质粒pET-28a-CPE,为进一步观察CPE对前列腺肿瘤等的生物学作用奠定了基础。

5.12汶川大地震气性坏疽感染伤员器械处置程序

目的探讨地震伤员气性坏疽感染伤员用后器械有效处理流程及方法。方法结合地震伤情特点,预见性制定了特殊感染器械的处理流程并严格实施。结果灭菌效果监测均达标,未发生医院感染病例。结论及时制定特殊感染器械处理流程,规范各环节操作,是控制发生气性坏疽医院交叉感染的有效措施。

地震伤并发气性坏疽的创面处理

目的总结地震伤并发气性坏疽的创面处理方法。方法回顾性分析18例地震伤并发气性坏疽患者的早期临床表现、诊断、创面处理及预后情况。结果18例中16例截肢患者未再行第2次截肢术,2例行清创及肢体局部切开减压,未行截肢术,所有患者临床治愈出院。结论早诊断,早治疗,全面管理患者创面,尽可能缩小组织坏死范围,提高临床救治水平,可减低病死率,同时还可避免院内交叉感染的发生。

气性坏疽病原菌特征代谢产物的气相色谱检测

气性坏疽病原菌群,属梭状芽孢杆菌属,专性厌氧,能引起严重的创伤感染。由气性坏疽病原菌引起的感染平时虽较少发生,但在特殊情况下仍会造成很大危害,因此有必要对这一菌群的代谢产物进行分析识别。采用本实验室建立的气相色谱检出和鉴定临床厌氧菌的实用方法。

从鸭羽为原料的水洗羽毛制品中分离到产气荚膜梭菌

目的:对水洗羽毛制品进行微生物污染调查,提示在我国加入世贸组织后,应高度重视水洗羽毛羽绒制品的卫生状况。方法:按照GB/T10288-2003《羽毛羽绒检验方法》附录A中A.6.4亚硫酸还原梭状芽胞杆菌的计数进行操作。结果:从一件以鸭羽为原料的水洗羽毛样品中分离到产气荚膜梭菌。结论:中国是全球最大的羽毛羽绒及其制品生产国和出口国,随着我国加入世贸组织,加强羽毛羽绒及其制品的监测,有利于避免遭受贸易壁垒,更有利于保障人民健康。

产气荚膜梭菌实验室诊断方法综述

气性坏疽不仅是战伤的严重并发症,也是其他创伤的严重并发症,其主要致病菌为产气荚膜梭菌。由于产气荚膜梭菌繁殖迅速,引起的临床症状严重,因此日益受到临床及实验室的广泛关注。近年来,国内外学者在对此菌的快速诊断方面作了大量的工作,本文就近年的研究成果进行综述。

小鼠气性坏疽动物模型的建立

目的建立产气荚膜梭菌感染小鼠的后肢的气性坏疽动物模型,为早期诊断、了解气性坏疽的致病机理及治疗方法提供依据。方法小鼠随机分成4组,每组10只。三个实验组分别肌肉注射3.5×109、3.5×108和3.5×107cfu/ml浓度的产气荚膜梭菌(ATCC13124)菌液0.1ml,空白对照组肌肉注射生理盐水0.1ml,72h后观察小鼠感染情况,取伤口分泌物作革兰氏染色涂片,细菌血平板厌氧培养和荧光定量PCR方法定量检测。结果 3.5×109、3.5×108、3.5×107cfu/ml实验组和对照组在肌肉注射72h内的死亡率为90%、70%、10%和0%。各组平均存活时间依次为(20:43±11:12)h、(37:24±25:39)h、(68:36±10:45)h和(72:00±0:00)h,死亡小鼠出现了气性坏疽的症状,分泌物培养和镜检出产气荚膜梭菌;未死亡小鼠康复;空白对照组无任何症状。各组Ct值均值为21.21±2.69、28.45±2.74、32.49±2.87和0.00±0.00,组间P值均<0.05。结论成功建立了不同浓度的产气荚膜梭菌在不同时间段内感染小鼠的后肢气性坏疽的动物模型,为了解气性坏疽的致病机理及治疗方法奠定基础。

基于免疫磁珠快速富集分离土壤中炭疽芽孢方法的建立

目的建立基于免疫磁珠快速富集分离土壤中炭疽芽孢的方法。方法将炭疽芽孢杆菌疫苗株培养形成芽孢,灭活后免疫家兔,获得多克隆抗体,与磁珠偶联制备免疫磁珠,并检测其在纯炭疽芽孢稀释液中对炭疽芽孢富集分离的敏感性。通过对模拟土壤样品中炭疽芽孢抽提效果的比较,选择最优的芽孢抽提液及抽提条件。采用多重PCR法评价免疫磁珠对土壤中的炭疽芽孢在PLET平板培养基上富集分离的效果。结果 10 mg磁珠经活化后与500μL抗体偶联效果最佳,制备的免疫磁珠在纯炭疽芽孢稀释液中,富集分离的敏感性可达19 cfu/mL。以0.5%Triton X-100蔗糖PBS溶液作为芽孢抽提液,经1 000×g离心5 min后芽孢提取率最高。在模拟土壤样品中,检测敏感性可达100 cfu/g土壤,PLET平板培养基检测的阳性率达30%。结论本研究建立的免疫磁珠法简单实用,适用于土壤等各种类型环境样品中炭疽芽孢的检测。

A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65的原核表达及其纯化

目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化。结果重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17%。利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5 h的表达产物经纯化后,纯度约达95%,蛋白收率为4.5 mg/g湿菌。结论已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础。