结核分枝杆菌对成骨细胞中抑瘤素M表达的影响

目的探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis MTB)对成骨细胞中促炎细胞因子抑瘤素M(oncostatin M,OSM)表达的影响。方法利用MTB标准株侵染成骨细胞模拟体外骨结核微环境。通过预实验筛选MTB侵染成骨细胞的最佳质量浓度和最佳作用时间。成骨细胞随机分为三组,A组为对照组,是未被MTB侵染的人成骨细胞组;B组和C组为实验组,分别是被感染复数为1:1和1:5浓度的MTB侵染的人成骨细胞,侵染时间为6小时。随后用荧光显微镜观察成骨细胞的凋亡情况;酶联免疫吸附试验检测上清液中抑瘤素M的表达水平。结果1.成骨细胞经MTB侵染后,凋亡明显增加,且随着感染复数增大,凋亡情况越明显。2.MTB侵染成骨细胞后,随着成骨细胞凋亡的增加,其分泌的OSM水平亦相应增加。结论OSM与MTB诱导的成骨细胞凋亡有关,OSM可能通过参与骨结核的炎性反应过程,影响成骨细胞的增殖与分化,进而参与骨破坏进程。

结核分枝杆菌潜伏感染抗原Rv2628c-Rv1737c融合蛋白的原核表达与免疫原性分析

目的原核系统表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染抗原Rv2628c-Rv1737c融合蛋白,并检测其能否被结核感染者外周血PBMC细胞识别,通过小鼠模型判定其免疫原性。方法按照原核系统密码子特点,全基因合成Rv2628c-Rv1737c表达核酸序列,构建表达质粒pET24a-Rv2628c-Rv1737c,原核细胞内诱导表达、亲和层析纯化Rv2628c-Rv1737c蛋白;分离不同患者样本PBMC细胞,抗原刺激后,通过q-PCR分析IFN-γmRNA表达差异,判定融合蛋白能否被TB感染者识别;联合融合佐剂DMT免疫BALB/c小鼠,检测体液免疫应答水平。结果原核克隆的重组表达质粒pET24a-Rv2628c-Rv1737c测序正确,融合蛋白以包涵体表达形式存在,经复性、亲和纯化后,分子量为57 kDa,纯度90%以上。以Rv2628c-Rv1737c融合蛋白刺激TB感染者,尤其TB潜伏感染(LTBI)者,外周血PBMC细胞IFN-γmRNA水平高于健康对照者(P<0.05);同时,BCG+Rv2628c-Rv1737c/DMT诱导小鼠能产生高水平的IgG抗体。结论原核重组可获得高纯度Rv2628c-Rv1737c融合蛋白,其作为潜伏感染抗原,可被TB感染者PBMC细胞识别,具有较强的免疫原性,是具有潜力的TB候选亚单位疫苗靶抗原,可用于TB感染尤其是潜伏感染的预防及实验室诊断。

非编码RNA调控结核分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的研究进展

结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的传染病,巨噬细胞自噬对于清除MTB具有重要作用,但MTB可以通过多种机制干扰宿主自噬,逃避巨噬细胞对其“灭杀”从而在宿主细胞内长期存活繁殖。在MTB感染的巨噬细胞中存在多种差异表达的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNAs),这些ncRNAs通过调控自噬相关基因表达在自噬的多个环节影响巨噬细胞清除MTB。因此,阐明这些调控网络对开发新的抗结核药物具有重要意义。该文综述了现阶段研究中ncRNAs调控MTB感染巨噬细胞自噬的相关机制,介绍了细胞自噬的发生过程以及ncRNAs的调控作用,以期为阐明TB的发病机制以及研发抗结核药物提供新的思路。

江西省耐多药结核分枝杆菌链霉素基因突变特征

目的了解江西省耐多药结核分枝杆菌中链霉素耐药的分子特征,探究北京基因型结核与链霉素耐药基因(rpsL、rrs和gidB)突变及链霉素耐药表型之间的关系。方法收集南昌大学第一附属医院高新医院及江西省胸科医院2021年1-12月分离的非重复耐多药结核菌106例,检测其耐药表型、是否为北京基因型及与链霉素耐药基因rpsL、rrs和gidB突变的关系。χ^(2)检验rpsL、rrs和gidB基因突变与北京基因型及表型关系。结果106例耐多药结核菌中链霉素耐药76例,其中58例rpsL 43A>G突变,8例88A>G突变,5例rrs突变,3例gidB突变。任何rpsL、rrs和gidB基因突变与表型耐药的符合率为89.6%,特异度及敏感度分别为86.7%和90.8%。北京型结核菌分离率为88.7%,其耐药基因突变主要集中于rpsL和rrs,非北京型菌耐药突变则主要集中于gidB;北京型菌更容易发生基因突变(P=0.013),但表型耐药无差异。结论rpsL、rrs和gidB基因突变与表型耐药符合率较好,可采用分子生物学直接检测耐药基因预判菌株耐药性;结核菌型与链霉素耐药特征具有紧密联系。

钙结合蛋白S100A4对BCG感染THP-1细胞自噬的调控作用

本研究旨在探究牛结核分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1后,钙结合蛋白S100A4对细胞自噬的调控作用。以感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞不同时间,用Western blot检测S100A4和LC3Ⅱ的表达,以确定最佳感染时间,并采用透射电镜观察自噬体数量变化。在BCG单独感染或与S100A4小干扰RNA共处理THP-1细胞12 h后,采用qRT-PCR检测S100A4及自噬相关因子--微管相关蛋白轻链3II (microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白7(autophagy-related gene 7, Atg7)、Beclin-1在mRNA水平上的表达,采用Western blot检测S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在蛋白水平的表达。利用mRFP-GFP-LC3检测自噬流,激光共聚焦显微镜观察细胞中mRFP-LC3和mRFP-GFP-LC3点状聚集。结果显示:在BCG感染THP-1细胞不同时间后,S100A4和LC3Ⅱ在蛋白表达水平随感染时间的延长先上升后下降,在12 h时表达最高(P<0.001),且自噬体数量明显增多。在mRNA水平上,与siNC组相比,siNC+BCG感染组S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的mRNA表达水平显著上调(P<0.05),当BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在mRNA水平的表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,P<0.001)下调;在蛋白水平上,与未感染组相比,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量显著增多(P<0.05),BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量均极显著减少(P<0.001);与未感染组相比,BCG组自噬体的数量极显著增多(P<0.01),siS100A4+BCG组与siNC+BCG组相比,自噬体的数量显著减少(P<0.05)。S100A4对BCG感染巨噬细胞诱导的自噬具有调控作用,S100A4能够促进BCG诱导的THP-1细胞自噬。

结核分枝杆菌膜囊泡RNA表达谱分析及功能研究

目的 描绘结核分枝杆菌膜囊泡(mycobacterium tuberculosis membrane vesicles,MVs)的RNA特征表达谱,分析其主要的生物功能,初步探索其诱导巨噬细胞凋亡的作用。方法 分离结核分枝杆菌MVs,提取总RNA,采用illumina Hiseq 2500-SE50平台进行双端测序。使用BWA软件进行序列比对,通过COG数据库对基因进行功能注释。通过MTT试验检测细胞存活率,采用Annexin-V联合PI染色法检测细胞凋亡。结果 本研究通过RNA测序及生物信息学分析描绘了结核分枝杆菌MVs中RNA的种类及含量,COG数据库功能注释结果显示这些RNA主要富集的生物学功能包括脂质转运代谢、氨基酸转运代谢、能量产生与转化、次级代谢物合成转运与代谢和转录等。生物分析显示富集的主要功能包括脂质转运代谢、氨基酸转运代谢、能量产生与转化、次级代谢物合成转运与代谢和转录等。功能实验表明,结核分枝杆菌MVs可以降低THP-1源巨噬细胞的存活率,促进细胞凋亡。结论 结核分枝杆菌MVs中含有丰富的短片段RNA,具有诱发细胞凋亡的作用。然而其具体作用机制仍需要更深入细致的研究。

融合蛋白RAP的免疫原性分析

目的结核病(Tuberculosis,TB)目前是全球单一感染源造成死亡的主要原因之一,且广泛接种的卡介苗对于不同人的效果不一且有一定的副作用,甚至在某些成年人身上效果甚微,为了获得效果更好、安全性更好的结核疫苗对融合蛋白RAP进行了分析验证。方法将融合蛋白RAP连接到pET30b原核表达载体上通过双酶切鉴定构建重组质粒、用热休克法和诱导剂诱导蛋白表并通过Ni-NTA纯化蛋白;全血干扰素释放测定法(WBIA)检测RAP刺激的人外周血中IFN-γ的水平;ELISA法检测小鼠特异性IgG、IgG1和IgG2a以及IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4的分泌水平。结果成功构建pET30b-RAP重组质粒并表达纯化RAP蛋白;RAP及其各组成蛋白能明显导致国内M.tb感染者分泌高水平的IFN-γ;小鼠经过RAP/MTO免疫后会发生Th1型反应产生特异性高滴度IgG抗体且使抗原特异性Th1型细胞因子分泌能力明显增强。结论根据得到的实验结果推断出RAP具有强大且特异性的免疫能力,所以有希望成为一种有前景的结核病候选疫苗。

结核分枝杆菌GroEL1蛋白表达、纯化及结构和功能的生物信息学分析

目的:应用基因工程技术和生物信息学方法对结核分枝杆菌GroEL1进行原核表达与纯化及其结构和功能预测,分析该抗原在新型结核疫苗的应用价值。方法:采用PCR技术体外扩增GroEL1基因,并克隆至pET28a质粒中,测序筛选构建成功的pET28a-GroEL1载体,将其载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,IPTG诱导表达重组GroEL1蛋白,利用镍亲和层析柱纯化。从UniProt数据库中获取H37Ra株GroEL1核苷酸和氨基酸序列;分别运用Protparam、TMHMM-2.0、Protscale、NetChop-3.1、Psortb、SignalP-4.1工具预测GroEL1蛋白的理化性质、跨膜螺旋、亲/疏水性、磷酸化位点、亚细胞定位,信号肽;NetNGlyc-1.0和YinOYang-1.2预测其糖基化位点;SOPMA和Swissmodel预测蛋白的二级结构和三级结构;Clustalw对同源序列进行比对。String预测相互作用蛋白,IEBD和ABCpred预测蛋白的B细胞抗原表位。结果:成功构建重组pET28a-GroEL1载体,GroEL1蛋白在大肠杆菌中部分以可溶形式表达。镍亲和层析柱纯化重组GroEL1蛋白,其纯度达90%以上。Western blot鉴定证实重组GroEL1蛋白具有良好的免疫反应性。结核分枝杆菌H37Ra株GroEL1基因全长1620 bp,编码539个氨基酸,分子量55.88 kD,等电点为4.98,预测显示该蛋白亲水性较强、性质稳定,无跨膜区,有37个可能的磷酸化修饰位点和8个O-糖基化位点,属于非分泌蛋白,定位在细胞质,二级结构显示α-螺旋占53.43%,延伸链占11.87%,β-转角占7.61%,无规则卷曲占27.09%,有多个B细胞抗原表位及多个与GroEL1蛋白相互作用蛋白。结论:成功表达并纯化重组GroEL1蛋白,运用生物信息学成功预测GroEL1蛋白的结构和功能,为结核病的预防、诊断和治疗奠定基础。

结核分枝杆菌游离DNA检测在肺外结核诊断中的价值

目的探讨结核分枝杆菌(MTB)游离DNA(cfDNA)检测技术在肺外结核诊断中的应用价值。方法选取2021年7月至2022年12月该院收治的高度疑似肺外结核患者266例作为研究对象,根据临床诊断结果,分为肺外结核组117例和非结核组149例。所有患者均采集脑脊液、胸腔积液、尿液及血液标本,并同时进行MTB cfDNA检测、结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测(GeneXpert MTB/RIF)、涂片抗酸染色及血液标本结核感染T细胞γ干扰素释放试验(TB-IGRA)。通过分析4种检测方法的效能指标评估MTB cfDNA检测技术在肺外结核病诊断中的临床价值。结果MTB cfDNA检测法对脑脊液、胸腔积液、尿液中MTB的检出率均显著高于涂片抗酸染色(χ^(2)=5.714、9.289、9.226,P=0.017、0.002、0.002)。虽然MTB cfDNA检测法对脑脊液、尿液中MTB的检出率高于GeneXpert MTB/RIF,但差异无统计学意义(χ^(2)=0.143,P=0.705;χ^(2)=0.648,P=0.421);MTB cfDNA检测法对胸腔积液中MTB的检出率显著高于GeneXpert MTB/RIF(χ^(2)=4.222,P=0.040)。在肺外结核组,MTB cfDNA检测法的MTB检出率为26.50%(31/117),显著高于GeneXpert MTB/RIF[15.38%(18/117)]和涂片抗酸染色[3.42%(4/117)],差异均有统计学意义(χ^(2)=4.362,P=0.037;χ^(2)=24.492,P<0.05);而TB-IGRA的MTB检出率为72.65%(85/117),显著高于MTB cfDNA检测(χ^(2)=49.850,P<0.001)。MTB cfDNA检测法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为26.50%、100.00%、100.00%、63.40%,其灵敏度显著高于GeneXpert MTB/RIF(15.38%)和涂片抗酸染色(3.42%),但低于TB-IGRA(72.65%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MTB cfDNA检测在肺外结核诊断中具有较高的灵敏度及特异度,故MTB cfDNA检测在肺外结核诊断中具有较好的应用前景。

流式细胞术检测荧光素标记结核杆菌的方法

目的:建立流式细胞术检测荧光素标记结核杆菌(M.tb)的方法。方法:以异硫氰酸荧光素(FITC)、二乙酸荧光素(FDA)、PKH26和碘化丙啶(PI)标记M.tb,应用流式细胞仪检测M.tb标记率。结果:FITC标记M.tb,在PBS缓冲液中,不同浓度FITC(10~40μg/ml)标记率随浓度增加而增高,FITC浓度10μg/ml标记率为85%,FITC浓度增加到40μg/ml标记率可达到93%,差异具有统计学意义(P<0.05);而在CB缓冲液中,不同浓度FITC(10~40μg/ml)标记M.tb标记率均在90%左右,差异无统计学意义(P>0.05)。FDA标记M.tb标记率均达到92%以上。PKH26标记M.tb标记率均达到90%以上。PI标记M.tb,酒精作用1 min标记率在47%左右,酒精作用2 min标记率达到97%左右,且标记率随时间增加而增高(P<0.05)。结论:建立流式细胞术检测荧光素标记M.tb的方法可为结核病基础研究提供实验思路。创新性建立应用荧光素FITC、FDA、PKH26、PI标记M.tb,并利用流式细胞术检测标记率,可为结核病基础研究提供实验思路。

2017—2019年福建省结核分枝杆菌分离株基因型特征及其耐药性分析

目的:了解福建省结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)基因型的分布特征和流行情况,同时分析MTB基因型与其耐药的关系。方法:选取2017—2019年福建省结核病耐药监测点的477株MTB临床分离株作为研究对象。采用对硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)生长实验法进行菌种初步鉴定,并采用传统固体比例法对9种抗结核药物[异烟肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampin,RFP)、链霉素(streptomycin,Sm)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、卡那霉素(kanamycin,Km)、氧氟沙星(ofloxacin,Ofx)、卷曲霉素(capreomycin,Cm)、丙硫异烟胺(prothionamide,Pto)、对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid,PAS)]进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。应用熔解曲线法间隔区寡核苷酸分型(McSpoligotyping)技术对菌株进行基因分型。结果:477株MTB菌株中北京基因型有245株,占51.4%;T家族有44株(含2株T,28株T1,7株T2,T3和T4各3株,1株T5),占9.2%;H家族有35株(含13株H,1株H1,21株H3),占7.3%;EAI家族有11株(含10株EAI2-Manila,1株EAI5),占2.3%;LAM3、Manu2和X1家族各有1株,分别占0.2%;所属家族未定义或不明确的有139株,占29.1%。聚类分析显示,各基因型家族主要流行型为北京家族的SIT1(44.9%,214/477)、T家族的SIT53(2.5%,12/477)、H家族的SIT742(1.9%,9/477)、EAI家族的SIT19(1.5%,7/477)。各家族MTB菌株与INH的耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=10.311,P=0.036),其中,EAI+LAM+Manu+X家族菌株对INH的耐药率最高[28.6%(4/14)];对RFP的耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=14.366,P=0.006),其中,EAI+LAM+Manu+X家族菌株对RFP的耐药率最高[21.4%(3/14)];对Ofx的耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=23.643,P=0.000),其中,H家族菌株对Ofx的耐药率最高[17.1%(6/35)];对PAS耐药率之间的差异有统计学意义(χ^(2)=9.550,P=0.049),其中,未定义家族菌株对PAS的耐药率最高[4.3%(6/139)]。结论:福建省MTB流行基因型以北京基因型为主,同时应重视未定义家族菌株的流行并加强对T家族、H家族和EAI等家族菌株的监测。菌株对INH、RFP、Ofx和PAS的耐药性与各基因家族相关。

新医科背景下课程思政路径探索——以结核分枝杆菌内容为例

以结核分枝杆菌内容为例阐释课程思政在新医科背景下运用混合式教学模式进行“文化素养”“职业素养”“生命仁爱”“家国情怀”“政治认同”“苏区红医精神”人文思政元素的融入路径设计。设计中“医学+人文+思政”有机结合,既契合新医科内涵,又用中国传统文化丰富了思政话语体系,并辅以苏区红医精神沁润,打造传授医学知识、解答医学疑惑的知识课堂;传播文化瑰宝、增强自信自强的文化礼堂;传承红色基因,赓续红色血脉的殿堂。

结核分枝杆菌表型药物敏感性试验临界浓度设定发展历程

结核分枝杆菌表型药物敏感性试验仍是耐药性检测的重要手段,但某些药物结果的准确性和可重复性较差,临界浓度是影响结果的关键因素之一。笔者对结核分枝杆菌表型药物敏感性试验临界浓度的建立及修订过程进行系统总结和介绍,为实验室技术人员和临床医生正确理解药物敏感性试验方法及结果,以及加强更新临界浓度的研究提供借鉴。

结核分枝杆菌分泌蛋白早期分泌性抗原6(ESAT-6)的免疫学性质及其在新型疫苗中作用的研究进展

早期分泌性抗原6(ESAT-6)是结核分枝杆菌(MTB)关键的毒力因子,可通过抑制巨噬细胞的吞噬杀菌功能与自噬反应抵抗机体对MTB的清除,从而减弱机体对MTB感染的免疫防御功能。此外,ESAT-6诱导的巨噬细胞的凋亡与固有免疫细胞的大量坏死可促进MTB的扩散、定植,引发MTB的全身感染。ESAT-6还可抑制Th1细胞的保护性免疫反应从而抑制相关促炎细胞因子的分泌,引发机体免疫功能的紊乱,加速MTB感染进程。在这一感染过程中,ESAT-6所具备的高度免疫原性使其可作为优势抗原用于新型结核病(TB)疫苗的研制,具有广阔的发展前景。

儿童结核病结核分枝杆菌临床分离株抗原基因pepA和PPE18的变异研究

目的对结核抗原编码基因pepA和PPE18进行测序,了解pepA和PPE18的基因多态性。方法选取重庆医科大学附属儿童医院感染科2006年12月至2013年12月收集的结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株168株,对应168例结核病患儿,年龄(7.8±5.7)岁,其中男孩87名,女孩81名。运用PCR方法扩增目的基因pepA和PPE18并进行测序,与结核标准株H37Rv基因序列以及从免疫表位数据库(immune epitope database,IEDB)中查询到的表位序列进行对比,分析pepA和PPE18基因序列中的变异特征。结果在168株菌株中,117(69.64%)株菌株出现了PPE18基因突变,且PPE18基因的17个T细胞抗原表位有10个发生了改变。168株临床结核分离株中,共6例(9.84%)结核菌株发生了pepA基因多态性,且未造成其T细胞抗原表位改变。结论抗原pepA基因序列较保守,PPE18存在基因高度多态性,预测会对由pepA和PPE18蛋白组成的M72疫苗的免疫功能造成影响,从而影响M72疫苗的免疫有效性。

吡嗪酰胺耐药的耐多药结核分枝杆菌pncA基因表达分析

目的 比较吡嗪酰胺(PZA)耐药的耐多药结核分枝杆菌在PZA药物刺激前后PZA耐药基因pncA的表达,探讨pncA基因表达与结核分枝杆菌PZA耐药的关系。方法 培养PZA耐药的耐多药结核分枝杆菌,检测其利福平和PZA最小抑菌浓度(MIC);以PZA浓度为0和50μg/mL的培养基培养菌株,实时荧光定量PCR检测菌株pncA的表达水平。结果 21株结核分枝杆菌PZA的MIC≥1 600μg/mL、12株为400~800μg/mL、5株为100~200μg/mL;分别定义相应PZA耐药水平为高、中、低,其利福平的MIC中位数分别为128、128、64μg/mL,任意2组利福平的MIC比较差异均无统计学意义(P均> 0.05);以相对定量2^(-ΔΔCt)法计算PZA高、中、低水平耐药结核分枝杆菌pncA表达水平,无药组分别为0.904(0.202,2.653)、1.157(0.658,1.511)、1.147(0.372,1.347),PZA浓度为50μg/mL处理组分别为1.544(0.611,3.191)、0.846(0.421,1.237)、0.726(0.225,3.017);以无药组为对照,PZA含药培养组与其对比,pncA基因表达差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 PZA耐药的耐多药结核分枝杆菌在PZA药物刺激前后pncA表达无明显变化。

云南省结核分枝杆菌分子特征和传播相关因素分析

目的 了解云南省结核分枝杆菌基因型分布特征、传播及其相关影响因素,为结核病控制提供政策依据。方法 收集云南省32耐药监测县(区)于2016年至2019年分离的分枝杆菌菌株,采用Spoligotyping和15个MIRU-VNTR位点技术对结核分枝杆菌进行基因分型。结果 共收集到846株结核分枝杆菌,539株为北京基因型(63.71%),307株非北京基因型包括T1(20.69%,175/846)、T3(4.49%,38/846)、T2(2.36%,20/846)等共16个基因型以及42株(4.96%)新发现或未定义菌株。846株结核分枝杆菌的成簇率为25.89%,其中北京基因型的成簇率为29.68%,非北京基因型成簇率为19.22%,两者差异有统计学意义(χ2=15.14,P <0.001);北京基因型和非北京基因型结核分枝杆菌与耐药无关;Logistic回归分析显示北京基因型成簇风险是非北京基因型的1.861倍(P <0.05,95%CI 1.376~2.516),而INH敏感菌株是耐药菌株的1.869倍(P <0.05,95%CI 1.129~3.094)。结论 云南省结核分枝杆菌基因型呈高度多态性,但北京基因型仍是主要流行株,云南省存在结核病的近期传播,北京基因型和INH敏感是近期传播的影响因素。

不同耐药型的结核分枝杆菌hspX基因序列与表达的比较

目的比较不同耐药型的结核分枝杆菌(MTB)热休克蛋白基因hspX序列与表达,初步探讨hspX与MTB的耐药是否存在相关性。方法选取4种一线抗结核药物全部敏感株(S)、同时对异烟肼和利福平耐药(MDR)和一种耐药[单耐利福平(MTB^(R+))、单耐异烟肼(MTB^(H+))、单耐链霉素(MTB^(S+))和单耐乙胺丁醇(MTB^(E+))]的菌株各10株,采用改良的十二烷基苯磺酸钠裂解法和TRIzol法分别提取各组菌株的DNA和RNA,使用特异性引物进行PCR和实时荧光定量PCR确定hspX基因的存在及其表达。对PCR产物进行测序以检查正向和反向的多态性,并用DNAman软件进行与标准株H37Rv序列比对。以敏感菌株(S)组为对照组进行两两对比分析不同耐药型的MTB菌株hspX表达的差异。结果PCR成功获得各组特异性的hspX基因,与H37Rv序列比对具有97%~99%的同一性,无存在明显差异;以相对定量2^(-ΔΔCt)法计算获得S、MDR、MTB^(R+)、MTB^(H+)、MTB^(S+)和MTB^(E+)菌株hspX的表达分别为0.98(0.89,1.23)、1.49(1.10,2.04)、1.41(0.55,2.80)、1.37(0.68,2.71)、0.91(0.59,1.62)和0.70(0.48,1.18)。以敏感菌株(S)组为对照组,不同耐药型菌株组与其比较,hspX表达差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论hspX基因在MTB中是保守的。在自然状态下,hspX基因在MTB的耐药性方面无明显相关性。

自然杀伤(NK)细胞应对结核分枝杆菌感染的研究进展

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的严重威胁人类健康的慢性传染病。自然杀伤(NK)细胞作为先天免疫的重要组成部分,在应对MTB感染时,NK细胞可分化出不同亚群,表现出受体和功能的多样性;并通过分泌细胞因子,串联其他免疫细胞发挥对MTB的抗感染作用,从而增强机体的抗MTB免疫应答反应。

MPT70构建、表达及免疫原性检测研究

目的以结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)菌膜相关抗原MPT70(Rv2875)为研究对象,构建重组载体pET30b-Rv2875并进行原核表达,开展小鼠实验评价其免疫原性。方法构建重组质粒pET30b-Rv2875及原核表达,以纯化的蛋白MPT70联合佐剂DMT。对BCG初免的小鼠进行增强免疫后,检测其血清中特异性抗体分泌水平及肺脏组织细胞因子mRNA表达水平。结果成功构建原核表达载体pET30b-Rv2875,表达、纯化及鉴定结果均符合预期。经BCG初免后,以MPT70联合佐剂DMT增免小鼠,其血清中特异性抗体滴度水平显著高于MPT70/DMT组、BCG组及DMT单独佐剂组,且BCG+MPT70/DMT组及MPT70/DMT组小鼠血清亚类抗体IgG2a与IgG1的比值大于1。BCG+MPT70/DMT组小鼠肺脏组织IFN-γ、TNF-α及iNOS等细胞因子mRNA表达水平显著高于其余各组,其后分别是MPT70/DMT组及BCG组。各组小鼠间肺脏组织IL-10细胞因子mRNA表达无显著性差异。结论重组蛋白MPT70联合佐剂DMT可诱导产生较为强烈的抗原特异性Th1型免疫应答,可作为新型结核病疫苗的候选靶抗原。