CDC42基因的激活和抑制对烟曲霉极性生长影响的初步探究

目的构建烟曲霉CDC42基因显性激活性(dominant active,DA)和显性抑制性(dominant negative,DN)点突变菌株,初步了解这两种点突变对烟曲霉极性生长以及RAC1基因表达的影响。方法运用分子生物学方法构建CDC42基因激活性(CDC42^(G14V))和抑制性(CDC42^(T19N))菌株;光学显微镜观察点突变菌落特征;RT-PCR方法检测Ku80、DA Cdc42和DN Cdc42菌株中RAC1的表达量。结果成功构建烟曲霉CDC42显性激活性(DA)和显性抑制性(DN)点突变菌株并经测序确认;烟曲霉DA Cdc42和DN Cdc42菌株的菌落生长直径、形成分生孢子数和各时间点孢子发芽率较对照株Ku80都明显降低,且差异均有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果表明DA Cdc42和DN Cdc42菌株中的RAC1的表达量均较对照株Ku80有所上升(P<0.05)。结论CDC42的激活和抑制都会对烟曲霉的极性生长产生负面影响;且会影响RAC1基因的表达。

累及多系统的播散性隐球菌1例

患者男,37岁。因劳累后右季肋部隐痛,阵发性咳嗽咳痰伴胸闷2周,近期体重下降2 kg而入院就诊。实验室检查:白细胞正常,嗜酸粒细胞9.40%,各项肿瘤指标正常,总蛋白:56.60 g/L、白蛋白:29.50 g/L,粪便真菌:阳性,痰涂片找到酵母样真菌;IgE:>2000.00 IU/ml。CT平扫(图1~4)显示右肺下叶近胸膜处见团片状高密度影,双肺见多发小结节影伴右侧肺门肿大淋巴结;脾脏增大,肝脏及脾脏见多发斑点及斑片状低密度影;肝脏门静脉周围见格利森(Glisson)鞘积液。

烟曲霉相关C型凝集素受体研究进展

烟曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)是最普遍的空气传播真菌病原体,可导致免疫功能低下患者发生致命的侵袭性曲霉病。对病原体与宿主免疫系统的相互作用过程的了解是理解其致病性的关键。通过保守的跨膜或可溶性的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)识别病原体表面上的保守分子结构,称为病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)。C型凝集素受体(C-type lectin receptors,CLRs)是PRRs中主要受体家族之一,CLRs可以通过C型凝集素样结构域(Ctype lectin-like domains,CTLDs)来识别β-葡聚糖、甘露糖、几丁质等真菌细胞壁成分,从而诱导固有免疫和获得性免疫来清除病原体。目前烟曲霉中所涉及的CLRs主要为Dectin-1、Dectin-2、MelLec、DC-SIGN等,这些CLRs在宿主细胞识别烟曲霉中起着至关重要的作用,并且针对Dectin-1及Dectin-2已开发出新型抗烟曲霉药物。因此为了进一步了解与烟曲霉相关的各类CLRs的作用机制及其相关信号通路,为开发新型抗真菌药物提供一种新思路,文章对与烟曲霉相关的CLRs最新研究进展进行了综述。

烟曲霉耐药机制研究进展

烟曲霉是重要病原真菌,主要感染免疫缺陷患者,不仅引起感染和过敏症状,还诱发曲霉肿、慢性肺曲霉病及严重的哮喘,甚至导致危及生命的侵袭性曲霉病。曲霉病临床预防和治疗过程中,抗真菌药物特别是唑类药物的频繁使用导致日渐严重的烟曲霉耐药问题。该文对烟曲霉耐药形势和产生机制进行综述,为临床烟曲霉感染治疗和新型抗真菌药物研发提供参考。

AGO和RDRP基因参与黄曲霉压力应激反应

目的探究RNA干扰(RNAi)机制中Argonaute(Ago)基因和RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因在黄曲霉生长发育中的作用。方法利用同源重组的方法构建黄曲霉Ago1、Ago2、RDRP1、RDRP3基因突变菌株,接种10^(6)CFU/mL孢子悬液3μl至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养基上观察突变菌株的生长发育现象。在小量酵母提取物葡萄糖(YGM)培养基中加入200、400μg细胞壁压力试剂刚果红(CR),0.8 mol/L、1.6 mol/L渗透压药物氯化钠(NaCl),氧化压力试剂2 mmol/L、4 mmol/L过氧化氢(H_(2)O_(2)),基因组损伤剂0.01%、0.02%甲磺酸甲酯(MMS)试剂分析突变菌株的压力应激反应。结果成功构建黄曲霉突变菌株ΔAgo1、ΔAgo2、ΔRDRP1、ΔRDRP3且生长发育正常。ΔAgo1、ΔAgo2菌株相比对照可降低对细胞壁和渗透压的胁迫影响。Ago1基因缺失可降低H_(2)O_(2)的影响,相反RDRP3基因缺失,H_(2)O_(2)的抑制作用增加。ΔAgo2、ΔRDRP1菌株能降低对基因损伤剂的作用。此外,ΔRDRP1增加渗透压胁迫作用。结论黄曲霉Ago1、Ago2、RDRP1、RDRP3基因不参与生长速率和无性繁殖调控,可以参与调节宿主菌对环境的应激反应。

黄曲霉基因敲除体系的构建及其RNA依赖的RNA聚合酶1基因在生长发育中的作用

目的探讨黄曲霉(A.flavus)基因敲除体系的构建和RNA依赖的RNA聚合酶1(RDRP1)基因在A.flavus生长发育中的作用。方法通过National Center for Biotechnology Information网址查找RDRP1基因,设计上下游序列引物,引入融合片段20 bp,采用重叠PCR(overlap PCR)法融合RDRP1基因上下游片段和嘧啶磺胺抗性基因(ptrA);采用聚乙二醇(PEG)介导方法将该融合片段导入A.flavus的原生质体中获得RDRP1阳性转化子(ptrA抗性),采用Sourthern blot鉴定筛选RDRP1基因突变菌株;对RDRP1基因突变菌株,采用十字交叉法测定生长速率、血细胞计数板统计产孢量,手动计数Wickerham Medium(WKM)+尿嘧啶尿苷(UU)培养基上产生的菌核数量。结果获得ptrA抗性转化子13个;Sourthern blot鉴定4个为RDRP1基因缺失菌株,效率30.8%;与CA14相比,RDRP1基因突变菌株在表型、生长率、产孢量及菌核发育上差异无统计学意义(P>0.05)。结论overlap PCR结合PEG介导转化的方式可短时间内获得A.flavus基因敲除突变菌株,RDRP1基因不参与A.flavus表型、生长率、产孢量及菌核发育的调控作用。

薯蓣皂苷对烟曲霉菌性角膜炎的作用及其机制

目的探究薯蓣皂苷(DS)对烟曲霉菌(AF)性角膜炎的作用及其机制。方法通过细胞存活实验(CCK-8)和Draize眼表毒性实验分别检测DS对RAW264.7细胞和小鼠角膜的毒性作用;应用扫描电子显微镜、透射电子显微镜、碘化丙啶摄取实验评估DS的抗真菌作用;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测RAW264.7细胞中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和核因子-红细胞2相关因子2(Nrf2)mRNA的表达,评估DS的抗炎作用;在AF性角膜炎小鼠模型中,通过裂隙灯拍照临床评分评估DS对AF性角膜炎的改善作用;通过平板菌落计数和苏木精-伊红(HE)染色分别评估DS在体内的抗真菌及抗炎作用。结果CCK-8和Draize眼表毒性实验结果显示,16 mg/L的DS对RAW264.7细胞和小鼠角膜无明显毒副作用(P>0.05);扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察显示,16 mg/L的DS能够使菌丝萎缩变形、破坏真菌细胞器及细胞膜;碘化丙啶摄取实验显示,16 mg/L的DS能够破坏细胞膜完整性;qRT-PCR检测显示,16 mg/L的DS可以显著升高Nrf2的mRNA表达,并抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达(F=40.31~126.81,P<0.001);临床评分、平板菌落计数和HE染色结果均表明,16 mg/L的DS可以明显改善AF引起的角膜炎症反应(F=18.27,P<0.001),降低真菌负荷(t=8.78,P<0.05)以及减少炎症细胞的浸润。结论DS可通过抗真菌和抗炎作用改善AF性角膜炎。

两性霉素B局部冲洗联合全身用药治疗曲霉菌性脓胸1例并文献复习

曲霉是一种广泛存在于自然界的腐生性真菌,可机会性感染免疫受损人群^([1]),引起多种肺部疾病,但导致曲霉菌性脓胸并不多见^([2])。肺曲菌病的治疗药物包括伏立康唑、伊曲康唑及两性霉素B等抗真菌药物,但由于难以进入胸膜腔,导致疗效欠佳。近年来有报道两性霉素B胸膜腔局部用药治疗曲霉菌性脓胸取得较好疗效^([3-5]),但均为个案报道。本文拟回顾性分析两性霉素B局部冲洗胸膜腔联合伏立康唑全身用药治疗曲霉菌性脓胸1例的临床资料,以分析临床特点,报道如下。

血根碱在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中的抗炎作用

目的探索血根碱(SAN)在小鼠烟曲霉菌感染角膜炎模型中的抗炎作用。方法应用CCK-8实验检测不同浓度SAN(0、62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0μg/L)对小鼠来源巨噬细胞(RAW264.7)增殖活力的影响;制备小鼠烟曲霉菌角膜炎模型,取感染第3天眼球,应用苏木精-伊红(HE)染色检测小鼠角膜组织炎症细胞浸润程度,ELISA法检测小鼠角膜组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)及环氧化酶2(COX-2)的蛋白表达水平;采用RT-PCR和ELISA方法检测巨噬细胞中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、TNF-α及单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的蛋白和mRNA的表达。结果500.0μg/L的SAN对RAW264.7细胞活性无影响(F=0.292,P>0.05);HE染色显示,500.0μg/L SAN组小鼠角膜组织炎症细胞浸润相较于模型组明显减少;500.0μg/L SAN可显著下调烟曲霉菌诱导的RAW264.7细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1的mRNA和蛋白表达及小鼠模型中TNF-α、COX-2的蛋白表达水平,差异均有显著性(F=20.939~2690.170,P<0.01)。结论SAN通过抑制炎症细胞浸润和下调炎症递质的表达在烟曲霉菌感染中发挥抗炎作用。

Rho-GTPases基因对烟曲霉和构巢曲霉细胞壁、菌丝形态、应激反应及毒力的影响

曲霉是广泛存在于自然界中的条件致病真菌,可导致侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA),常见的致病菌有烟曲霉、构巢曲霉、黄曲霉、黑曲霉等。近些年来IA的发生率呈上升趋势,同时全球高达20%的曲霉分离株对常用的抗真菌药物表现出耐药性。Rho-GTPases家族基因以rho1、cdc42和rac1的研究最为广泛,它作为“分子开关”调节真菌形态发生与侵袭力。该文主要综述了rho1、cdc42和rac1对烟曲霉和构巢曲霉细胞壁合成、菌丝形态建立、应激反应及毒力的影响,有助于厘清曲霉极性生长和致病性方面的分子机制,为抗真菌药物的研发提供新思路。

唑类耐药烟曲霉在江苏不同农田流行特点研究

目的横断面调查江苏地区农田唑类耐药烟曲霉热点环境及流行特点。方法江苏省苏北和苏南地区共采集68份农田土壤标本,通过培养分离烟曲霉菌株,进一步进行体外抗唑类药物敏感实验筛选唑类耐药烟曲霉(azole resistance Aspergillu fumigatuS,RAF)菌株,并对分离的RAF菌株扩增cyp51A基因鉴定耐药突变表型。结果68份农田土壤标本,共分离获得106株烟曲霉菌株,34株(34/106株,耐药率32%)为RAF,其中8株检测到cyp51A基因突变(7株TR46/Y121F/T289A,1株TR34/L98H/S297T/F495I),这8株RAF菌株对伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑同时耐药,均对伏立康唑高度耐药(MIC>16 mg/L)。其余26株RAF菌株未检测到任何cyp51A基因突变;RAF在草莓田地最多(16株/34株),稻田次之(8株/34株);苏北农田RAF检出率高于苏南农田,深层土壤RAF检出率略高于表层土壤。结论江苏农田RAF菌株检出率高达32%,以非cyp51A基因相关耐药机制为主。草莓大棚田地可能是江苏地区农田RAF产生的潜在热点,建议对农业中使用的杀菌剂进行管理,有助于控制临床上的真菌耐药问题。

细胞壁多糖相关基因对烟曲霉细胞壁完整性和生长的影响

曲霉属有300多种,烟曲霉在环境中最为丰富,是侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的主要致病菌。即使在早期诊断和治疗的情况下,IA死亡率也高达50%[1]。烟曲霉具有优越的生存和生长能力。饥饿时,烟曲霉产生分生孢子(无性孢子),在空气中传播,并保持休眠状态,遇到适宜代谢活化的环境,则打破休眠,分生孢子膨胀并发芽,形成菌丝体并又产生分生孢子[2]。这个过程会经历两个重要的形态变化。第一个形态变化是细胞膨胀,称为各向同性生长。第二个形态变化是极性生长,芽管形成[3]。这些形态学变化伴随着细胞壁的重塑。

烟曲霉生物膜耐药性研究进展

烟曲霉是曲霉中最常见的一种致病真菌[1],其无性孢子可释放到空气中,人类每天吸入成百上千的这种传染性繁殖体,由于烟曲霉孢子体积小(直径2~3μm),可绕过黏液纤毛清除而滞留在下呼吸道。在免疫功能低下的个体中,曲霉分生孢子可以萌发成具有组织侵袭性的菌丝,传播并引起侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)[2]。IA是一种很难控制的真菌疾病,病死率极高[3]。在侵袭性曲霉病中,烟曲霉表现为被细胞外基质(extracellular matrix,ECM)包围的多细胞群落,这是生物膜的特征[4],生物膜增加了耐药性,使一些曲霉病对传统的抗真菌治疗无效,这为我们的治疗带来了重大的临床挑战[5]。

小GTPase蛋白在烟曲霉耐药性和致病力中作用的研究进展

烟曲霉是广泛存在于自然环境中的腐生真菌,其产生大量的分生孢子易被人体吸入肺中,在一定条件下可造成艾滋病患者和器官移植患者等免疫低下人群的感染。已有研究显示,临床中侵袭性曲霉感染致死率达50%以上,而造成这种高致死率的原因与烟曲霉菌丝极性生长、压力应激和免疫逃逸等过程有关[1-2]。此外,临床上也面临烟曲霉对抗真菌药物(如三唑类和棘白菌素类等)耐受水平不断升高的棘手难题,这其中重要的耐药分子机制包括药物靶点突变/靶点高表达.

免疫功能低下曲霉菌感染机制的实验研究

目的通过免疫力低下曲霉菌感染动物模型的建立,探讨免疫力低下曲霉菌感染机制。方法兔耳静脉大剂量注射甲泼尼龙造成动物免疫力低下,采用乳胶增强散射比浊法测定免疫功能;通过病理组织切片PAS染色,观察动物感染模型主要脏器的病理改变。结果给实验动物注射甲泼尼龙3d后,可使动物免疫指标下降(与用药前检测值相比);组织病理学结果,曲霉菌感染后,可使心、肺、肝、肾等多脏器发生病理改变,特别是肺脏和肾脏的病理改变,从而导致肺功能和肾功能的衰竭。结论曲霉菌感染可使免疫力低下动物造成多脏器的病理改变;加强免疫功能低下曲霉菌感染机制的研究,对曲霉菌感染的诊断、治疗、预防和控制具有重要的意义。

深圳市肉类食品空肠弯曲菌的污染情况调查

目的了解我市常见肉类食品中空肠弯曲菌的污染状况,为控制和预防空肠弯曲菌食物中毒提供科学依据。方法在食品污监测点随机抽检肉类食品样品117份,用传统国标法和荧光PCR法进行检测。结果从117份肉类食品中检出4份空肠弯曲菌,阳性检出率为3.4%。结论深圳市肉类食品中存在空肠弯曲菌的污染,如果加工、销售不当,及监督不严,会对群众健康构成潜在威胁。

海门地区黄曲霉毒素暴露与肝癌危险流行病学研究

对１９９６年在江苏海门进行的以人群为基础的肝癌病例与对照研究对象血清各６４份，并从海门肝癌队列研究对象中采集１９８７年、１９９２年一般人群的血清６２份和７４份。应用夹心ＥＬＩＳＡ法测定黄曲霉毒素血清清蛋白加合物水平。结果表明：ＡＦＴ－ＨＳＡ水平与肝癌危险明显相关（ＯＲ＝２．４０，９５％ＣＩ１．５０～３．８３，Ｐ＜０．０００１），且肝癌危险度随加合物水平升高而明显增高（χ２＝１５．１４２，Ｐ＝０．０００１）。比较１９８７年、１９９２年和１９９６年当地居民加合物水平发现，１９９２年和１９９６年加合物水平较１９８７年有明显下降。说明改食大米为主粮虽使得当地居民摄入黄曲霉毒素量有所下降。

侵袭性肺曲霉病的临床特征分析

目的分析侵袭性肺曲霉病(IPA)的临床特征,以期为早期诊断、合理治疗及预防提供依据。方法对解放军454医院经病理检查确诊的14例IPA患者,结合文献分析其基础疾病、症状、体征、X线胸片和CT、病理检查、治疗方案以及疗效等。结果14例患者均合并有基础疾病,其中肺癌5例(35.7%),慢性阻塞性肺疾病3例(21.4%),肺脓肿2例(14.3%),白血病化疗后2例(14.3%),肺结核1例(7.1%);糖尿病1例(7.1%);所有病例均有发热及咳嗽、咯痰,其他常见的症状还有咯血(71.4%)、呼吸急促(57.1%)、盗汗(57.1%)、胸痛(42.9%)等;X线胸片及CT可表现为空气新月征、全肺弥漫性片状或团片状阴影、单发或多发肿块或结节影等;抗真菌药物治疗10例,顺利出院4例,病情进展并死亡4例,自动出院2例,手术治疗4例患者均顺利出院。结论IPA好发于免疫缺陷患者,其临床表现无特异性,X线胸片及CT可见相应征象,确诊有赖病理检查,药物治疗效果欠佳,病程迁延或反复咯血以及不能与肿瘤鉴别者可以考虑手术治疗。

烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化

目的从烟曲霉菌培养上清液中分离纯化具有抗真菌活性的肽类物质 (FIP)。方法用离子交换柱层析法分离 ,用反相高效液相色谱法进一步纯化 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确定相对分子质量。结果从烟曲霉菌培养上清液中分离出一种具有抗真菌活性的FIP。纯化后得到高活性的精制FIP ,其相对分子质量约为 8kD ,MTT法测定结果表明 ,FIP对 5种真菌均具有明显的抗真菌效应。结论烟曲霉菌培养上清液中含有抗真菌活性的肽类物质。

Sensititre YeastOne显色药敏板与微量肉汤稀释法检测曲霉体外抗真菌药物敏感性的一致性研究

目的评估显色药敏板Sensititre YeastOne与微量肉汤稀释法检测曲霉体外抗真菌药物敏感性的一致性。方法使用同样的孢子悬液按照CLSI M38-A2微量肉汤稀释法和Sensititre YeastOne YO10对307株曲霉进行体外抗真菌药物敏感性试验,计算两种药敏方法结果间的基本一致性、分类一致性以及错误率。结果CLSI M38-A2药敏试验显示98.4%(302/307)曲霉菌株对测试的6种抗真菌药物持野生型状态,Sensititre YeastOne则检出97.1%(298/307)菌株为野生型。除伊曲康唑外,其余5种抗真菌药物在Sensititre YeastOne与CLSI M38-A2间的基本一致性均>90%。两种方法在曲霉药物敏感性检测的分类一致性为98.1%(301/307),极显著错误率为0.3%(1/307),显著错误率为1.6%(5/307)。结论Sensititre YeastOne在检测曲霉体外药物敏感性方面与CLSI方法一致性良好,可用于临床实验室曲霉体外药敏检测。