阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78·0%(39/50)。结论构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。

阴道毛滴虫分子致病机制的研究进展

阴道毛滴虫是一种常见的寄生原虫,以性传播为主。近年来对阴道毛滴虫致病机制的研究日益受到重视,本文从黏附因子、纤黏连蛋白、层黏连蛋白、G蛋白、成孔蛋白、蛋白酶和细胞骨架等方面综述阴道毛滴虫的分子致病机制。

阴道毛滴虫dsRNA病毒部分基因的克隆与序列分析

提取阴道毛滴虫总核酸为模板,根据GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒序列(U08999,NC003873,NC003824,NC003834)设计1对简并引物,经RT-PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物,将其进行克隆、测序,得到目的基因片段长度为1454bp,与阴道毛滴虫病毒T1株(U08999)的序列同源性最高为82.9%。

中性粒细胞杀灭阴道毛滴虫作用的研究

目的研究中性粒细胞对阴道毛滴虫的杀灭作用。方法将滴虫性阴道炎患者的阴道分泌物接种于肝浸汤培养基,获阴道毛滴虫。取患者静脉血分离血清,取其1ml于56℃30min获补体失活血清。另取1ml患者血清于0℃以阴道毛滴虫吸附3次,获去除抗体血清。用密度梯度离心法及聚合物加速沉降法分离、纯化患者静脉血中性粒细胞。用氮蓝四唑(NBT)和沙黄O(safranin O)染色,显微镜观察中性粒细胞与阴道毛滴虫相互作用及甲臢(NBT还原产物)颗粒(formazan)沉积。取300个阴道毛滴虫和3×104个中性粒细胞,分别在有氧或厌氧、有或无超氧化物岐化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)、有或无补体等不同条件下,培养10、20、30、40、50及60min,再接种于固态琼脂培养基,在37℃厌氧条件下继续培养5d。观察计数阴道毛滴虫存活率。结果显微镜下可见几个中性粒细胞同时围攻杀灭1个阴道毛滴虫。含有中性粒细胞时培养的虫体存活率,厌氧条件下为85%,有氧条件为3%(P﹤0.01)。SOD及CAT可明显降低其杀虫作用,培养60min虫体存活率分别为98%及94%,而无SOD及CAT时虫体存活率为2%(P值均<0.05)。加入去除抗体血清,可将虫体全部杀灭。加入补体失活血清则无杀虫作用。结论中性粒细胞杀灭阴道毛滴虫作用依赖于氧及患者血清中补体的存在。

阴道毛滴虫半胱氨酸蛋白酶基因变异分析

目的研究阴道毛滴虫半胱氨酸蛋白酶(TvCP)基因变异特点,为分子种系发生和遗传进化等提供参考资料。方法利用PCR扩增TvCP基因,用pBS-T或pET28b载体构建重组质粒,转化大肠埃希菌,筛选阳性克隆,测定目的基因序列。通过以序列相似性为基础的数据库搜索方法检索同源序列,利用Clustal X、DNAstar等软件分析TvCP基因核苷酸和氨基酸序列多态性、遗传变异和进化规律。结果克隆的TvCP2和TvCP3基因与数据库中相应参考序列在核苷酸和氨基酸水平上的相似性均为99%以上,高度保守。克隆的TvCP4基因与TvCP4参考序列在核苷酸和氨基酸水平上的相似性为97.5%以上,属于TvCP4基因家族的两个不同成员。根据阴道毛滴虫基因组数据库信息,经分析表明TvCP4酶前体由305个氨基酸残基组成,共有大小一致的TvCP4同源分子9个和N-末端缺少部分氨基酸残基的同源分子2个,它们之间的氨基酸序列相似性为62.3%～96.7%。TvCP4、TvCP1-3、TvCP12、TvCP25和半胱氨酸蛋白酶65(CP65)之间也有同源性,氨基酸序列相似性约为61%～88.2%。此外,阴道毛滴虫还拥有为数众多的其他组织蛋白酶L样成员,TvCP构成呈高度多样性。序列联配和聚类分析表明TvCP酶活性位点、酶前体结构中ERFNIN样基序和形成二硫键的半胱氨酸残基数目和位置非常保守,进化树分析也表明它们可能由共同的祖先分子通过基因复制和不断突变进化而来。结论TvCP组成一蛋白酶家族,家族内各成员酶活性位点上残基高度保守,但其他位点上的序列呈现高度多态性;推测TvCP家族各成员可能由一个共同的祖先基因分子进化而来,在保持酶基本功能的同时又赋予多样的功能。

阴道毛滴虫标本染色方法的改进

作者在制作阴道毛滴虫染色标本中,采用盖玻片推片,在染液的配制、比例、浓度、pH值上作了适当的调整,使虫体各部位着色清晰。此法简便、快速、染色效果好,保存时间长。

利用PCR技术检测阴道毛滴虫体内的人型支原体

采用人型支原体16SrDNA的特异引物,对从广州市多所医院门诊患者分离到的28株阴道毛滴虫进行PCR检测,结果有12株感染了人型支原体,感染率为42.9%。这显示了阴道毛滴虫和人型支原体之间的共生关系在中国具有普遍性。

阴道毛滴虫RRas同源基因的克隆和序列分析

目的克隆和分析阴道毛滴虫RRas同源基因,以探讨其在细胞内信号传导通路中的功能。方法从已构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离得到一个与人类RRas同源的cDNA克隆,用PCR扩增该cDNA克隆TvRRas相对应的基因组DNA,并对cDNA克隆及其对应的基因组DNA进行测序。利用BLASTP,RPS-BLAST和ClustalW等工具进行序列分析。结果TvRRascDNA序列全长705对碱基,读码框含615对碱基,推测蛋白质序列具205个氨基酸。序列分析显示该基因的基因组DNA序列含有5′端ATG起始密码子和3′端的终止密码子,与cDNA序列完全一致,提示该基因无内含子;进一步分析表明该基因系RRas亚家族的同源基因,其氨基酸序列与人类和小鼠的RRas同源性最高(两者的一致性均为51%,相似性均为70%),同时拥有人类RRas基因高度保守的结合GTP的结构域和完全一致的效应结构域。进化树分析表明该基因与人类的RAS原癌蛋白基因分支及RRas分支聚类。结论获得了阴道毛滴虫RRas同源基因。

阴道毛滴虫半胱氨酸蛋白酶3基因的克隆、表达与免疫原性分析

目的研究小鼠对阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)半胱氨酸蛋白酶3(TvCP3)重组蛋白的免疫应答。方法用PCR方法从阴道毛滴虫基因组DNA扩增TvCP3基因编码序列,分别用编码前体酶和成熟酶的基因片段构建重组表达质粒pET28b-TvCP3和pET28b-TvCP3C,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)后进行诱导表达,通过金属螯合层析法(im-mobilized metal affinity chromatography,IMAC)纯化表达产物重组蛋白,复性后免疫BALB/c小鼠。BALB/c小鼠分为TvCP3免疫组、TvCP3C免疫组和对照组3组,每组6只,分别用TvCP3重组蛋白、TvCP3C和PBS免疫小鼠。第1次25μg/只,福氏完全佐剂乳化;第2次25μg/只,福氏不完全佐剂乳化;第3次与第4次12.5μg/只,水剂。前3次免疫间隔2周,第4次间隔1周。末次免疫后1周用ELISA测定血清抗体滴度。采集高滴度小鼠血清制备免疫血清,通过蛋白质印迹(Western blotting)分析抗体所识别的阴道毛滴虫虫体或其分泌物中的特异性抗原组分。结果重组表达质粒pET28b-TvCP3和pET28b-TvCP3C均能在E.coli BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白占菌体总蛋白的25%以上;ELISA结果显示,纯化的重组蛋白TvCP3和TvCP3C免疫小鼠4次后血清抗体效价分别达1︰204800和1︰102400;Western blotting分析显示,小鼠免疫血清能特异性识别表达产物中的目的蛋白,以及阴道毛滴虫虫体或分泌物中的特异性抗原组分。结论重组表达质粒pET28b-Tvcp3和pET28b-Tvcp3C可在E.coli BL21(DE3)中高效表达,纯化的表达产物具有良好的免疫原性。

人型支原体共生与阴道毛滴虫甲硝唑耐药性的关系

目的研究人型支原体(Mycoplasma hominis)的共生与阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)甲硝唑耐药性的关系。方法2010年11月至2011年7月,自四川省妇幼保健院妇科门诊患者生殖道分泌物中分离出160株阴道毛滴虫,用梯度浓度1 024、512、256……4、2和1μg/ml甲硝唑分别处理该批虫株,以死亡率≥90%的最低浓度作为甲硝唑最小致死浓度(MLC)。以160个阴道毛滴虫分离株中提取的DNA为模板,用PCR技术特异性扩增人型支原体16S rRNA基因,检测滴虫细胞内是否有人型支原体共生。对检出人型支原体DNA的分离株用32μg/ml多西环素清除支原体,比较清除前后甲硝唑MLC的变化。结果 160个阴道毛滴虫分离株中甲硝唑MLC为1～8μg/ml的占61.3%(98/160),16～32μg/ml的占26.3%(42/160),64～256μg/ml的占12.5%(20/160)。PCR检测结果显示,有61株(38.1%)检出人型支原体DNA,其中MLC为1～8μg/ml的分离株检出率为13.3%(13/98),16～32μg/ml的分离株检出率为73.8%(31/42),64～256μg/ml的分离株检出率为85.0%(17/20),不同MLC范围的分离株人型支原体检出率差异有统计学意义(P<0.01)。用多西环素处理后,61株中仅有8株支原体被清除,清除前后甲硝唑MLC无明显变化。结论四川地区的阴道毛滴虫分离株对甲硝唑表现出一定程度的耐药性,人型支原体的共生可能与之有关,但尚未发现直接证据。

阴道毛滴虫接触依赖性细胞毒性的分子作用及化学基础

阴道毛滴虫(以下简称滴虫)寄生于人体泌尿生殖道,在接触依赖性致病过程中,虫体对靶细胞的黏附起着关键性的作用,滴虫合成的酶分子可直接损伤上皮细胞,滴虫寄生部位的局部免疫反应可起到免疫保护作用,但炎症分子和免疫细胞又可加重病变损害,从整体水平来看,阴道毛滴虫的细胞毒性作用是多分子和多化学因素参与的共同结果。

蜂胶体外抗阴道毛滴虫实验

体外无菌培养的阴道毛滴虫加入蜂胶溶剂,观察不同作用时间、不同蜂胶浓度和蜂胶在不同滴虫密度下的杀虫效果。蜂胶作用0、6、12和24h后,阴道毛滴虫存活率分别为(91.50±3.11)%、(43.00±6.83)%、(22.25±5.32)%和(11.50±5.74)%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。蜂胶浓度分别为0.24、0.48、0.96、1.92、3.84和7.68mg/ml作用24h后,滴虫存活率分别为(88.00±5.29)%、(92.67±4.16)%、(90.0±6.00)%、(84.00±4.00)%、(2.67±1.15)%和0。蜂胶作用时间越长和/(或)蜂胶浓度越高,杀虫效果越明显。

中草药白头翁对阴道毛滴虫蛋白的影响

采用浓度为0.625mg/ml白头翁水提液进行体外抗阴道毛滴虫(简称滴虫)实验,药物作用2h和4h后,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测白头翁作用后滴虫可溶性蛋白组成和含量变化。结果显示,正常滴虫蛋白图谱共有28条蛋白带。药物作用2h,与对照组比较,5条蛋白带含量增加,4条蛋白带含量明显降低。药物作用4h,与对照组比较,5条蛋白带含量增加,5条蛋白带含量明显降低,另出现一条新蛋白带。

阴道毛滴虫铁氧还蛋白基因真核表达质粒的构建

作者用螯合树脂(Chelex-100)提取阴道毛滴虫基因组DNA,PCR扩增出阴道毛滴虫铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因,克隆入pMD-18T载体,亚克隆至pcDNA3·1(+)真核表达质粒。经PCR及酶切鉴定,Fd基因体外扩增产物为306bp,与已知序列吻合。成功构建了Fd基因的真核表达质粒。

阴道毛滴虫病病原学诊断方法研究进展

阴道毛滴虫病是一种发病率较高的性传播感染性疾病,近年来的研究显示阴道毛滴虫感染是男性非淋球菌性尿道炎的病因之一,并且是促进人类免疫缺陷病毒感染的因素之一,本病的诊断主要依赖于实验室检测。文中介绍阴道毛滴虫病的病原学诊断方法的研究进展。

抗阴道毛滴虫AP33单克隆抗体的制备及其功能初探

目的制备阴道毛滴虫(T.υ317株)黏附蛋白抗原(AP33)单克隆抗体并初步分析鉴定其功能。方法将制备和纯化的融合黏附蛋白33(rAP33)为抗原,免疫BALB／c小鼠,共免疫3次(抗原含量分别为100、50和100μg),每次间隔2周,末次免疫后3 d取小鼠脾细胞及SP2／0骨髓瘤细胞在聚乙二醇(PEG1500)作用下进行细胞融合,筛选出高滴度分泌的McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析其特异性,间接免疫荧光实验(IFAT)进行定位,并初步探讨其体外对阴道毛滴虫黏附HeLa细胞的抑制作用。结果经筛选获得能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7和4H11)杂交瘤细胞株,经免疫球蛋白类型和亚型鉴定为IgG1; ELISA和Western blotting分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;IFAT显示其中4株(4F11, 4F8,4E7,4H11)可识别培养的阴道毛滴虫,体外滴虫黏附抑制实验显示终浓度分别为200、200、400和200μg/ml,该4株单抗体外对滴虫黏附HeLa细胞的抑制率分别为50．08％,65．03％、50．70％和49．08％。结论制备的抗重组AP33单克隆抗体,体外对阴道毛滴虫黏附有较好的抑制功能。

改良吉氏染色法观察体外培养的阴道毛滴虫分裂繁殖

采用改良吉氏染色法观察体外培养的阴道毛滴虫分裂相。结果显示,分裂间期为66.5%,二分裂期为24.1%,多分裂期为9.4%。二分裂虫体可划分为前有丝分裂期、前期、中期、后期和末期。多分裂虫体可见含3～7或8个子体,其中含3和4个子体的分别占69.1%和24.5%。还可见一些形态异常虫体。

阴道毛滴虫沉默信息调节因子2同源基因的原核表达载体构建及表达

提取阴道毛滴虫(T.vaginalis)LX006细胞株传代培养细胞总RNA,RT-PCR扩增Tv-Sir2-like全长cDNA链,扩增产物连接到T-A克隆载体并转化大肠埃希菌(E.coli)JM109。提取重组克隆质粒,并用限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ进行双酶切,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-41b,并在E.coliBL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果显示目的基因定向克隆于原核表达质粒pET-41b获得了表达重组子,IPTG诱导该原核表达载体在E.coliBL21中表达相对分子质量(Mr)约为59000的重组融合蛋白,表达量占菌体总蛋白量的30%。

MGE-PCR分析不同临床表现的阴道毛滴虫分离株

目的分析引起不同临床表现的阴道毛滴虫分离株的遗传特性。方法用移动遗传因子(mobile geneticelements,MGEs)-PCR技术对30个不同临床表现的阴道毛滴虫分离株(轻度3株、中度22株、重度5株)基因组进行扩增,用邻位相连法(neighbor joining,NJ)对扩增产物进行聚类分析。结果阴道毛滴虫分离株间的遗传差异明显,遗传距离在0～1间均有分布,平均遗传距离为0.69,根据遗传距离构建的树状聚类图有3大聚类,临床表现轻度组(Tv4、Tv14和Tv26)分布于聚类2;重度组(Tv10、Tv15、Tv13、Tv21和Tv25)分布于聚类1;除了Tv2、Tv5、Tv17和Tv28外,其余18株均属于进化树顶部的大分支(聚类3)。。其中Tv12和Tv29、Tv18和Tv20、Tv14和Tv26、Tv10和Tv25、Tv15和Tv21的遗传关系最为密切,遗传距离为0。结论 30个阴道毛滴虫分离株基本上是按照引起临床表现轻重差异而聚类的,提示阴道毛滴虫引起的临床表现与其基因差异性有关。

贵州省部分地区阴道毛滴虫与人型支原体共生情况

目的:了解贵州地区阴道毛滴虫临床分离株与人型支原体共生情况。方法:以贵州部分地区女性阴道毛滴虫病患者阴道后穹隆分泌物中采集的阴道毛滴虫虫株,实验室达到纯培养后,采用Chelex-100的方法提取滴虫基因组DNA,设计人型支原体16S rDNA特异引物,进行聚合酶链式反应(PCR),琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行分析,观察滴虫细胞内人型支原体共生情况。结果:从临床共采集到165株虫株中,83株获得纯培养;83株中人型支原体检测结果显示有47株阳性,阳性率为56.6%。结论:阴道毛滴虫虫株与人型支原体共生情况在我国贵州地区普遍性存在。