中缅边境地区间日疟原虫几丁质酶基因的遗传特性分析

目的明确中缅边境地区间日疟原虫几丁质酶(Plasmodium vivax chitinase,PvCHT1)基因的遗传多样性,探究PvCHT1基因的地理差异,为我国间日疟疫苗的设计提供参考。方法收集中缅边境地区(云南腾冲)、中国内陆地区(安徽合肥、河南郑州)PvCHT1基因序列,同时从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)下载获取缅甸、柬埔寨、泰国、越南、印度尼西亚、马来西亚、巴布亚新几内亚、巴西、哥伦比亚、秘鲁和墨西哥等11个国家的PvCHT1基因序列。采用MEGA、DnaSP、KaKs_Calculator、Arlequin、STRUCTURE和NETWORK软件,分别对所有基因序列的遗传多样性、基因进化、遗传分化、种群结构和单倍型网络进行分析。结果共获得中缅边境地区(6条)、中国内陆地区(10条)PvCHT1基因序列16条,从NCBI下载其他11个国家的PvCHT1基因序列551条。遗传多样性分析显示,中缅边境地区的PvCHT1基因有25个多态位点,其中16个为非同义突变,最常见的突变位点是E617D(占31.57%)和I272M(占31.04%);中缅边境地区的PvCHT1基因核苷酸多样性(π=0.00079)略高于中国内陆地区(π=0.00071)和缅甸(π=0.00075)。基因进化分析显示,中缅边境PvCHT1基因的中性检验(Tajima’s D)值<0,非同义替换与同义替换之比(Ka/Ks)>1。遗传分化分析显示,中缅边境地区PvCHT1基因与中国内陆之间的近交系数(FST)为0.31,与缅甸的FST为-0.05,与柬埔寨、泰国、越南、印度尼西亚、马来西亚之间的范围为0.04~0.15,与巴布亚新几内亚、巴西、哥伦比亚、秘鲁、墨西哥之间的FST范围为0.24~0.56。种群结构分析显示,所有种群结构的最佳组数为7,其中,中缅边境种群由K1~K6组分构成,以K5为主。单倍型网络分析显示,存在4个单倍型地理集群,除中国内陆和墨西哥外,其他国家均共享单倍型H5。结论中缅边境地区PvCHT1基因高度保守,提示其可作为传播阻断疫苗候选靶标;PvCHT1基因在不同种群中存在明显的地理差异,因此在设计疫苗时应更具针对性。

基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除约氏疟原单克隆虫株的构建

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法:根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息,设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂,将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接,构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体,尾静脉注射感染小鼠,24 h后采血查获疟原虫后,给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫,喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定,最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠,8 d后采血镜检疟原虫,PCR鉴定,筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内,每只接种1×105感染疟原虫的红细胞(iRBC)。对感染后的小鼠每2天鼠尾取血制作血涂片,经吉姆萨染色后镜检计算原虫率,记录数据进行统计学分析。结果:PCR扩增出的PALM左右同源臂各600 bp以及sgRNA序列,与载体pYCm-golden-blue连接后成功获得用于电转染的PALM基因敲除的CRISPR质粒。该质粒电转染的疟原虫在小鼠体内经药物压力筛选8 d,用PALM基因内部引物经PCR检测显示PALM基因缺失,用基因组特异性引物经PCR检测出现阳性重组条带,片段长度1246 bp。随后将阳性重组条带切胶测序,测序结果进一步证实PALM基因敲除成功。在获得约氏疟原虫PALM基因敲除株的基础上,通过有限稀释感染12只小鼠,经PCR自2只小鼠血液中扩增出单一PALM基因敲除条带,检测不到野生型疟原虫的残留,获得了2个100%PALM基因敲除的单克隆虫株。PALM基因敲除单克隆株与P.yoelii 17XNL感染小鼠后均出现原虫血症,且2组小鼠原虫率逐日升高。感染后第10天,2组小鼠原虫血症水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建并单克隆化PALM基因敲除的P.yoelii 17XNL虫株,为疟疾遗传减毒红前期活疫苗研发提供准备。

疟疾患者外周血T淋巴细胞亚群检测及临床意义

目的探讨疟疾患者外周血T淋巴细胞亚群的变化及其临床意义。方法选取2020年1月~10月期间广州医科大学附属市八医院就诊的49例病人标本,分为疟疾患者组(n=36)和健康对照组(n=13),采用流式细胞技术检测其外周血T淋巴细胞亚群,比较两组间T淋巴细胞亚群绝对计数与百分比的差异性;将疟疾患者组分为恶性疟组(n=33)与卵形疟组(n=3),比较两组间T淋巴细胞亚群绝对计数与百分比的差异性;将疟疾患者组分为普通型组(n=30)与重症型组(n=6),比较两组间T淋巴细胞亚群绝对计数与百分比的差异性;同时比较恶性疟患者治疗前后的T淋巴细胞亚群绝对计数与百分比的差异性。结果疟疾患者组CD45+(882.21±595.94个/μl),CD3+(636.00±390.84个/μl),CD3+CD4+(363.81±234.90个/μl)和CD3+CD8+(230.92±81.93个/μl)T淋巴细胞绝对计数值均低于健康对照组(2291.15±674.20个/μl,1680.15±510.72个/μl,934.15±317.80个/μl,615.07±280.14个/μl),差异具有统计学意义(t=7.11,7.67,6.88,4.62,均P<0.05);重症型患者组CD3+(398.36±254.74个/μl),CD3+CD4+(223.36±102.80个/μl)T淋巴细胞绝对计数值均低于普通型患者组(723.42±400.74个/μl,426.46±242.42个/μl),差异具有统计学意义(t=2.46,3.46,均P<0.05);治疗后的CD45+(2019.63±779.879个/μl),CD3+(1969.00±738.48个/μl)淋巴细胞绝对计数值较治疗前升高(1023.00±601.85个/μl,985.25±595.97个/μl),差异有统计学意义(t=3.54,3.65,均P<0.05)。其余结果差异均无统计学意义(t=0.85~2.86,均P>0.05)。结论疟原虫感染主要影响T淋巴细胞亚群绝对计数,而对T淋巴细胞亚群百分比无影响,提示T淋巴细胞亚群绝对计数在疟原虫感染检测及治疗预后具有重要临床意义。

我国恶性疟原虫对氯喹抗性的消长

目的 监测停止或减少使用氯喹防治恶性疟后恶性疟原虫对氯喹抗性的变化。 方法 采用世界卫生组织 (WHO)制定的体外微量法和体内四周法 ,在停用氯喹后不同时间测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。 结果 海南省乐东县抱由镇体外法测定抗性率由 1981年的 97 9%降至 1997年的 2 6 7% (P <0 0 1) ,完全抑制裂殖体形成的平均药浓度由 10 46± 7 14 pmol/μl血 降至 1 63± 1 47pmol/μl血 (P <0 0 1) ,用较高药浓度 (>6 4pmol/μl血)才能完全抑制裂殖体形成的病例所占比例由 83 3 %降为 6 7% (P <0 0 1)。体内法测定抗性率由 1981年的 84 2 %降为 1997年的 18 4% (P <0 0 1) ,三级抗性 (RⅢ )占抗性病例的比例由 5 3 1%降为 14 3 % (P <0 0 1) ,血中无性体疟原虫平均消失时间由 72 0± 2 1 6h变为 5 0 7± 16 1h。2 0 0 1年三亚市雅亮乡体外法测定抗性率为 5 9 8% ,平均抑制药浓度 3 5 6± 2 12 pmol/μl血 。 2 0 0 3年乐东县福抱乡体内法测定抗性率为 62 5 % ,RI、RⅡ和RⅢ分别占抗性病例 5 0 %、 3 0 %和 2 0 % ,无性体疟原虫平均消失时间 5 6 9± 17 2h。云南省勐腊县体外法测定抗性率由 1981年的97 4%降至 1999年的 77 8% (P <0 0 1) ,完全抑制裂殖体形成的平均药物浓度由 17 2± 12

2例输入性卵形疟的实验室检测

目的比较输入性卵形疟实验室检测方法,分析他们的基因特征。方法分别用吉氏染色镜检、CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒和巢式PCR等3种方法。对2例河南省自刚果(布)务工归来的输入性卵形疟病例进行检测,并比较检测结果。对2例外周血中疟原虫的18S rRNA基因进行测序、基因特征和同源性分析。结果2例患者均通过吉氏染色镜检观察到典型的卵形疟原虫形态,巢氏PCR均扩增出与卵形疟预期一致的特异性条带,但CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒检测结果均为阴性。对2例外周血中疟原虫的18S rRNA基因测序,获得一条长度均为906 bp的序列,GC含量为35.4%,与已知卵形疟18S rRNA的基因序列(GenBank登录号为AB182492)同源性为99%。结论巢式PCR检测与吉氏染色镜检结果一致,CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒检测阴性则不能排除卵形疟原虫感染。

2012年全国寄生虫病防治技术竞赛成绩分析报告:Ⅰ.疟原虫检测能力考评结果分析

目的对2012年全国寄生虫病防治技术竞赛疟原虫检测能力考评成绩进行分析,了解防治专业人员的疟原虫检测能力。方法2012年5月,以省(市、区)为单位,每省选送各级疾控机构的在职专业技术人员4名(年龄≤45周岁,县级不少于2名)参赛。竞赛内容包括疟原虫厚、薄血片制作(每参赛选手30 min内制作完成3张血片,并做吉氏染色;计满分为10分,6分为及格)和疟原虫虫种鉴别、计数(每选手镜检5张血片,每张8 min,其中定性5分,定量1分,共计6分;计满分为30分,18分为及格)。用SPSS 11.6软件分别从参赛选手的性别、年龄、职称、单位级别、所在省份疟疾流行程度、经济发展状况和地理方位等方面对参赛选手疟原虫检测成绩进行统计学分析。结果本次竞赛共来自全国30个省(市、区)120名选手参加。血片制作平均成绩为8.7分,最高者为10分、最低者为5.8分,及格人数为118人,占98.3%;疟原虫镜检平均成绩为16.0分,最高者为29分,最低者为0分,及格人数为52人,占43.3%。疟原虫平均检出符合率为65.4%,17人(14.2%)达到100%,39人(32.5%)低于60%。间日疟和恶性疟的检出符合率分别为62.6%和67.8%,阴性标本的符合率为40.0%。不同性别、年龄、职称、单位级别参赛选手之间的成绩差异均无统计学意义(P>0.05);不同疟疾流行程度、地理方位和经济发展水平省份间选手成绩间差异均有统计学意义(P<0.05)。其中血片制片和镜检读片成绩,疟疾流行一类(9.29±0.41和18.17±6.42)、二类(8.92±0.79和18.31±6.94)和三类省(8.61±0.89和15.63±7.52)的参赛选手均高于非疟疾流行省份(7.95±1.00和10.19±7.01)(P<0.01);南方省份参赛选手(9.16±0.61和18.82±6.78)均显著高于北方省份(8.30±0.99和13.23±7.45)(P<0.01)。东部省份参赛选手的镜检读片成绩(18.20±6.88)显著优于西部省份(13.39±7.60)(P<0.05),两者血片制片成绩差异无统计学意义(P>0.05)。结论各省疟原虫检测能力总体水平尚不均衡。

云南省恶性疟原虫对氯喹抗性的纵向监测

应用ＷＨＯ推荐的体外微量测定法于停用氯喹前的１９８１年及停药后的１９８４、１９８８—１９９０和１９９２年在云南省南部的勐腊县测得恶性疟原虫对氯喹的抗性率分别为９７．４％、１００％、９６．１％及９３．７％；ＩＤ５０依次为１７０、１３２、１２５及１１０ｎｍｏｌ／Ｌ，ＩＤ９５为１０００、７４０、７０７及５７６ｎｍｏｌ／Ｌ；平均抑制量分别为５５．４、４６．７、４５．８及３５．４ｐｍｏ１／井。与１９８１年测得结果相比，抗性率无明显变化；ＩＤ５０分别下降２２．３％（Ｐ＜０．０５）、２６．４％（Ｐ＜０．０５）及３５．３％（Ｐ＜０．０１），ＩＤ９５依次下降２６．０％（Ｐ＜０．０５）、２９．３％（Ｐ＜０．０５）及４２．４％（Ｐ＜０．０１）。平均抑制量分别下降１５．７％（Ｐ＞０．０５）、１７．３％（Ｐ＜０．０５）及３６．１％（Ｐ＜０．０１）。提示云南南部恶性疟原虫对氯喹的抗性并不稳定，而是随药物压力的下降而降低。

云南南部恶性疟原虫对氯喹、咯萘啶、青蒿琥酯、哌喹敏感性的体外测定

1988及1990年在滇南恶性疟流行区用体外微量法测得恶性疟原虫对氯喹、咯萘啶、青蒿琥酯及哌喹的抗性率分别为98.7％(75/76)、27.6％(16/58)、13.8％(9/65)及97.7％(43/44);半数抑制量(ID_(50))分别为125.0、19.0、4.7及243.3nmol/L,抗氯喹恶性疟原虫对哌喹有明显的交叉抗性;对咯萘啶及青蒿琥酯则未见明显的交叉抗性。抗青蒿琥酯恶性疟原虫对以上3种药均有一定程度的交叉抗性。抗咯萘啶恶性疟原虫对青蒿琥酯无交叉抗性,而对氯喹及哌喹有一定程度的交叉抗性。

苏、鲁、豫、皖、鄂五省疟疾联防30年效果评价

目的分析和评价苏、鲁、豫、皖、鄂五省疟疾联防30年的效果。方法依据五省疟疾疫情报告和联防统计数据,进行综合分析评价。结果联防30年,五省疟疾发病减少,流行程度降低,阻断了恶性疟传播,五省发病数占全国发病比例下降。近10年疟疾疫情回升,实际发病数是疫情报告数的6倍。结论五省疟疾联防效果显著,联防形式及实施的措施应予肯定;巩固和发展五省疟防成果仍应坚持联防,但应探索适应新形势的联防机制和内容。

巢式PCR技术在输入性疟疾监测中的应用

目的评价巢式PCR技术在高疟区回国人员疟疾监测中的应用价值。方法收集2007-2009年自非洲、东南亚等疟疾流行区回国人员中疟疾现症患者及其他无症状高危人群的滤纸血,采用巢式PCR技术检测疟原虫ssRNA基因,并与血片镜检结果进行比对。结果巢式PCR检测53例血检确诊的疟疾现症患者均为阳性,两法的阳性符合率为100%,其中PCR检出恶性疟、间日疟混合感染6例,高于镜检检出的3例。检测疟疾流行区返回的高危人群157人,镜检阳性3例,阳性率1.91%;巢式PCR阳性5例,阳性率为3.18%;其中,镜检阳性、巢式PCR阴性的1例,镜检阴性、巢式PCR阳性的3例,两种方法的阳性符合率为66.7%,阴性符合率为98.1%,两法检测结果一致的血样占检测血样的97.5%。结论巢式PCR技术对输入性疟疾的监测具有实用价值。

IFN-γ激活巨噬细胞产生一氧化氮杀伤疟原虫的作用

目的 :观察 IFN- γ激活的巨噬细胞 ( MΦ)合成的一氧化氮 ( NO)及其在疟疾保护性免疫中杀伤疟原虫的作用。方法 :体外分离培养小鼠腹腔 MΦ,与不同浓度的 γ干扰素 ( IFN- γ)共育 4 8h后 ,加入分离的寄生疟原虫的红细胞 ,观察激活的 MΦ NO产生水平及其对疟原虫的杀伤作用。结果 :IFN-γ能激活 MΦ产生 NO,其产生的量与 IFN-γ的浓度有关 ;MΦ对疟原虫的杀伤作用与 NO的释放量呈显著相关关系 ( r=0 .898,n=13,P<0 .0 1) ;N-硝基 - L -精氨酸 ( N- nitro-L- arginine,L- NNA)能抑制 NO合成 ,同时也降低 MΦ 的杀伤活性 ;感染约氏疟原虫的 BAL B/c小鼠注射 L- NNA,导致原虫血症上升 ,小鼠死亡率升高。结论 :IFN- γ激活 MΦ产生 NO可能是杀伤疟原虫的重要作用机制。

河南省3例输入性三日疟的诊治分析

采用吉氏染色镜检、CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒和巢式PCR等3种方法,对2011年河南省3例自安哥拉和赤道几内亚归国的三日疟患者血样进行检测。2例自安哥拉归来的患者分别于回国后15 d和27 d发病;另1例患者曾在赤道几内亚发病,归国2个月后再次发病。3例患者均有发热、头痛和畏寒等症状,但发热规律不典型。2例患者出现总胆红素升高、脾大等临床表现。3例患者镜检均可见典型的三日疟原虫形态,巢式PCR检测均扩增出与三日疟预期一致的特异性条带,但CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒检测结果均为阴性,3例患者均经复方青蒿素类药物(ACT)治愈。

云南和海南两省不同地区恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2基因型的研究

目的 分析云南和海南两省恶性疟原虫的基因型及其分布。方法采用套式PCR法特异扩增MSP2基因中间多态区 ,对恶性疟原虫群体进行基因分型。结果 检测云南省 31例和海南省 2 9例恶性疟原虫患者血清 ,其中分别有 14和 18种不同的MSP2等位基因型 ,其等位基因株存在高度的多态性 ,基因片段大小及分布频率具有地区差异。海南省不同等位基因型虫株混合感染及多重感染现象比云南省严重。

大劣按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的 探讨大劣按蚊血淋巴酚氧化酶 (PO)与约氏疟原虫卵囊黑化的关系。方法 以大劣按蚊 /约氏疟原虫模型 ,利用聚丙酰凝胶电泳后的酶底物显色法 ,比较、分析血餐后 5、7、11、15d时不吸血组、吸正常血组和感染组 3组的雌大劣按蚊血淋巴酚氧化酶的单酚氧化酶 (MPO)和双酚氧化酶 (o DPO)活性 ;同时观察感染组约氏疟原虫的感染度及其卵囊黑化比率。结果 感染组的血淋巴MPO和o DPO酶活性明显高于不吸血组和吸正常血组 (P <0 .0 5 ) ;但是随着约氏疟原虫卵囊黑化比率的增高 ,感染组血淋巴MPO和o DPO活性逐渐下降。另外 ,吸正常血组的MPO和o DPO酶活性明显高于不吸血组 (P <0 .0 5 )。结论 吸血和约氏疟原虫的感染均能激活大劣按蚊前酚氧化酶级联反应 。

一种便于现场测定恶性疟原虫抗药性的培养基

为了各地开展体外微量测定法调查恶性疟原虫的抗药性,研制了便于现场调查使用的培养基。将连续培养恶性疟原虫用的RPMI1640完全液体培养基用安瓿封装,冰瓶贮存.可供现场50d内使用。该培养基的效果与冰冻干燥培养基相似,明显优于WHO培养基。

套式PCR检测滤纸干血滴中恶性疟原虫的研究

目的：建立简易、实用的套式ＰＣＲ检测恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）的方法。方法：以小亚单位核糖体核糖核酸基因（ＳＳＵｒＤＮＡ）为目的片段的双温度点套式ＰＣＲ扩增滤纸干血滴中Ｐ．ｆ．ＤＮＡ，并将结果与镜检法进行比较研究。结果：１４３例标本中两法均阳性和均阴性分别有５５份和５１份，镜检阴性而ＰＣＲ阳性者３４份，镜检阳性而ＰＣＲ法阴性３份。套式ＰＣＲ总阳性率为６２％，显著高于镜检法的４１％，两者符合率为７４％。结论：本法简便、快速，敏感性高、特异性强，具有一定的现场应用价值。

云南南部边境地区居民易患疟疾危险因素分析

目的了解云南南部边境居民易患疟疾的影响因素。方法采用分层整群不等比例抽样方法确定调查点,问卷调查居民一般情况,疟疾常识知晓情况,疟史、蚊帐使用情况等。计算机录入资料、建立数据库,在SPSS13.0软件作logistic回归分析。结果共调查云南南部4县114个自然村11414人、16种因素。回归分析显示,男性、少数民族、未婚状态、户外露宿是居民患疟疾的危险因素(OR值分别为1.295、12.212、1.430和3.085)。结论应加强云南南部边境地区男性居民和少数民族居民的疟疾预防。

PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究

目的 :在同一反应体系中建立能鉴别诊断间日疟与恶性疟的 PCR检测方法。方法 :根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 3个引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,在同一反应体系中 ,间日疟原虫和恶性疟原虫分别预期被扩增出 34 1bp和 4 31bp的 DNA条带。结果 :间日疟原虫和恶性疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小的 DNA片段 ,并经限制性酶切证实 ;杜氏利什曼原虫、弓形虫、健康人血及空白对照均无特异性扩增条带 ;以该检测体系至少可检出原虫血症为 2 .56× 10 -7间日疟原虫感染和 1.0 8× 10 -5恶性疟原虫感染 ;69份镜检阳性的间日疟和 2份恶性疟患者血样 PCR检测均为阳性 ,1例发热待查患者 PCR诊断为间日疟 ,与镜检复查结果一致 ,所有疟疾阳性标本中未检出混合感染 ,2 0份健康人血 PCR均为阴性。结论 :该检测体系灵敏、特异 ,对于诊断间日疟和恶性疟以及鉴别间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有一定的应用价值。

运用Kriging法对我国黄淮流域疟疾空间分布特征的研究

目的研究我国黄淮流域疟疾空间分布特征。方法收集安徽、河南及湖北省沿黄淮流域地区2005年有疟疾报告的156个市、县的当年发病率资料,利用Arcgis 9.0软件建立疟疾发病的地理信息系统,并在该软件的统计学扩展模块支持下,利用Kriging法对已建立的疟疾地理信息系统数据库进行空间插值分析,根据无偏最优的原则绘制疟疾发病概率的空间分布图,建立半变异函数,并对预测值的标准误差的分布制图。结果2005年黄淮地区疟疾发病分布呈空间自相关,自相关阈值98 928 m,其变异函数为球形模型,显示疟疾发病分布呈空间聚集性。交叉检验显示Krig-ing法生成的疟疾概率分布图是对黄淮地区疟疾空间分布的最优无偏估计,标准化均值为0.008 621。结论Kriging法能较好估计黄淮地区疟疾的空间分布特征,该地区的疟疾在空间分布上与距离有关,并呈现以安徽省中北部与河南交界及河南省与湖北省交界的两个明显的聚集中心,而且其空间分布并非与行政区划分类完全一致。