我国南方五省间日疟原虫环子孢子蛋白基因型与疟疾防治效果关系的探讨

目的探讨我国南方间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因型种群结构、疟区分类及其防治意义。方法应用单管-套式/多重PCR对采自海南、云南、广西、广东、贵州等5省(自治区)共346份间日疟原虫阳性患者滤纸血样作环子孢子蛋白(CSP)基因型鉴定,结合5省(自治区)疟疾历史资料和近年流行状况进行分析。结果广东、广西和贵州等3省(自治区)疟原虫PV-1型温带族虫株均占90%以上,热带族仅有个别发现,未见PV-2型;云南省疟原虫PV-1温带族占71.4%、热带族占28.6%,PV-2型仅个别发现;而海南省PV-1型温带族、热带族和PV-2型等3大基因型类群分别约占1/3。结论广东、广西和贵州等3省(自治区)间日疟原虫PV-1型温带族占绝对优势,疟疾控制效果好,而海南、云南两省间日疟原虫基因型类群较复杂,疟疾控制难度大,说明间日疟原虫种群基因型结构复杂性和多重感染程度是影响当地间日疟流行势态及其防治效果的重要因素,是防治与监测中重要的流行病学指征之一。

间日疟原虫环子孢子蛋白PCR-RFLP多态性分析

采集2011年河南省间日疟原虫阳性患者血样,用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)法分析环子孢子蛋白(circumsporozoite protein,CSP)基因型,并结合流行病学资料进行初步种群分布分析。共采集间日疟患者血样37份,根据流行病学调查确定河南当地感染病例血样26份,输入性病例血样11份。37份血样均扩增出1条约750 bp的条带。PCR-RFLP结果显示,CSP基因PV-Ⅱ型1份,占2.7%,PV-Ⅰ型36份,占97.3%。26份当地病例血样CSP基因均为PV-Ⅰ型,其中PV-Ⅰ-a型占42.3%(11/26),PV-Ⅰ-b型占57.7%(15/26);11份输入病例血样中,PV-Ⅰ-a型占90.9%(10/11),PV-Ⅱ型占9.1%(1/11),未见PV-Ⅰ-b型。提示河南省当地流行的间日疟病例中,CSP基因PV-Ⅰ-b型略多于PV-Ⅰ-a型;输入性间日疟病例中PV-Ⅰ-a型占优势。

环子孢子蛋白基因检测法对1例间日疟病例的溯源

对2014年1例初诊为河南省本地感染的间日疟病例进行实验室检测与流行病学溯源调查,以明确其感染来源。收集该病例的流行病学资料,分别采用厚薄血膜吉氏染色法、疟疾快速诊断试纸(RDT)法和巢式PCR法检查患者外周血液,并对其环子孢子蛋白(CSP)基因序列进行分析。流行病学调查显示,该患者曾于2013年5月至缅甸停留约1周,同年6月发病,确诊为间日疟,经青蒿琥酯治疗后,疟原虫转阴,症状消失。CSP基因序列分析显示,该患者前后两次发病时的血样扩增出的CSP序列的中央重复区完全一致,与缅甸分离株(Gen Bank登录号为ABS95455和ABS95456)的序列一致性分别为95.1%和100%,与2个河南分离株HN3和HN7(登录号为KP888996和KP889000)的序列一致性分别为88.8%和67.1%。推测该病例为输入性间日疟复发病例。

中缅边境间日疟原虫环子孢子蛋白基因分型

根据间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因设计特异分型引物,利用巢式PCR技术(Nested-PCR)对采自中缅边境的间日疟患者血样作分型鉴定。检出的174份血样中,PV-I型热带族占54.6%(95/174)、温带族占35.6%(62/174)、PV-II型占2.9%(5/174)、混和感染占6.9%(12/174)。表明中缅边境的间日疟原虫存在4种基因型,以热带族为优势虫株,缅甸拉咱与云南腾冲间日疟原虫CSP基因型构成无差异(χ2=3.381,P>0.05)。

外源性一氧化氮体外杀伤红内期间日疟原虫的实验研究

目的探讨外源性一氧化氮(NO)对红内期间日疟原虫的杀伤作用。方法采集以早期滋养体期为主,原虫密度>0.5%的患者血样,配成含2%红细胞的虫血混悬液。96孔板中每孔加100μl虫血混悬液,再加入各组试剂,亚硝基铁氰化钠(SNP,分别为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mmol/L),SNP+血红蛋白(Hb)0.15mmol/L,SNP+硫酸亚铁(FeSO4)0.15mmol/L,SNP+L-半胱氨酸(L-cyst)1.00mmol/L,SNP+FeSO40.15mmol/L+L-cyst1.00mmol/L,后4组SNP浓度均为1.00mmol/L,设对照组,每组重复3次,置37℃5%CO2培养箱中培养。根据虫龄,估计发育至裂殖体时间,提前3h取空白对照孔涂片镜检,确定终止培养时间,培养终止后吉氏染色,镜检计数成熟裂殖体,计算NO对红内期间日疟原虫的抑制率,统计分析各组对间日疟原虫抑制率的差异。结果SNP0.02mmol/L组,间日疟原虫抑制率为(0.84±1.69)%,对培养的红内期间日疟原虫无杀伤作用(P>0.05);SNP0.05mmol/L组,间日疟原虫抑制率为(12.26±3.04)%,对培养的红内期间日疟原虫存在杀伤作用(P<0.01)。且抑制率随SNP浓度上升而升高。在含有1.00mmol/LSNP的孔中分别加入Hb、L-cyst、FeSO4和FeSO4+L-cyst与只添加SNP1.00mmol/L孔相比,红内期间日疟原虫抑制率自(85.40±2.90)%下降为(5.90±2.90)%、(25.86±4.02)%、(30.16±2.75)%和(16.71±2.30)%。结论外源性NO对体外培养的红内期间日疟原虫有杀伤作用,而Hb、L-cyst和FeSO4可以逆转这种杀伤作用。

从Giemsa染色的血膜中扩增间日疟原虫DNA方法探讨

目的建立从Giemsa染色的血膜中提取疟原虫DNA的方法。方法分别采用Na2HPO4法和Chelex-100离子交换法,经过反复优化,提取血膜中的DNA,进行套式PCR扩增鉴定PvMSP-1等位基因型。结果用Na2HPO4法和Chelex-100离子交换法分别提取40张不同类型的间日疟原虫阳性血膜DNA,未染色的厚血膜全部扩增出目的基因条带,而染色的薄血膜未能扩增出目的基因条带。两种方法均可检测红细胞间日疟原虫感染率≥0.01%的血涂片。结论从多年保存的标准血膜中提取疟原虫DNA进行基因型鉴别是可行的。

间日疟原虫安徽地域株乳酸脱氢酶基因序列同源性分析

采集安徽省蚌埠市区、五河县、怀远县、蒙城县和利辛县2009-2010年的39例间日疟患者血样,分别提取DNA,PCR扩增间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)基因,并克隆测序,以及Blast序列分析。结果显示,克隆的PvLDH基因片段为951 bp。序列分析发现,采自安徽地区的39例间日疟患者血样的PvLDH基因序列之间无差异(登录号为GU078391),与GenBank中其他地域株的PvLDH基因序列同源性均>99%,氨基酸序列仅分别与EJEU60134株和MIA061251株存在1个氨基酸的差异。

间日疟原虫裂殖子表面蛋白3α基因多态性的研究进展

间日疟原虫裂殖子表面蛋白3α(Plasmodium vivax merozoite surface protein-3α,PvMSP-3α)是红内期间日疟原虫裂殖子形态的一种表面蛋白。PvMSP-3α基因在世界范围内具有高度基因多态性,是对间日疟原虫进行基因分型和流行病学研究较合适的分子标记物,为开发抗疟疫苗提供了重要候选抗原。本文就PvMSP-3α的分子结构、基因多态性和基因分型作一综述。

云南省输入性间日疟原虫多药抗性蛋白1基因突变多态性分析

目的分析云南省输入性间日疟原虫的多药抗性蛋白1基因(Pvmdr1)突变多态性。方法对云南省2020年和2021年诊断为间日疟原虫感染的病例血样进行Pvmdr1全基因扩增及测序,以间日疟原虫Sal‑Ⅰ分离株的序列(GenBank登录号:NC_009915.1)为模板设计PCR反应引物,用MEGA 5.04软件与编码区参比序列(GenBank登录号:XM_001613678.1)进行比对,用DnaSP 6.11.01软件分析单倍型和单核苷酸多态(SNP)位点及其突变类型,并计算核酸多样性指数π、单倍型期望杂合度(He)等,用Network 10.0软件构建中介网络进化图。结果共收集276份输入性间日疟患者血样,其中自缅甸感染病例占99.3%(274/276),自非洲、巴基斯坦感染各占0.4%(1/276)。259份血样扩增获得4392 bp的Pvmdr1全基因序列,提交GenBank获得的登录号为OP559204~OP559462。259条DNA序列π、Ka/Ks比值分别为0.00076和3.6006,共检出22个SNP,包括13个非同义突变和9个同义突变。仅c.4074C>T位点突变在2020、2021年的检出率[15.0%(21/140)、5.9%(7/119)]差异有统计学意义(χ^(2)=5.546,P<0.05)。次等位位点为c.1587A>G(97.9%,253/259),新检出SNP包括c.2499G>T(2.3%,6/259)、c.3358C>T(0.4%,1/259)、c.3832C>T(0.4%,1/259)。c.3064C>T、c.4065A>G、c.3358C>T和c.3832C>T突变位点仅在2021年的患者血样中检出,其中前2个SNP从非洲感染的分离株中检出,后2个SNP从缅甸感染的分离株中检出。259条Pvmdr1完整编码区与参比序列(单倍型Hap_1)比对,识别出26种单倍型(Hap_2~Hap_27),均为参比序列(单倍型Hap_1)的突变型,He为0.8907。其中,Hap_8的检出率最高(18.5%,48/259),非洲感染分离株中仅检出Hap_19。2020、2021年的患者血样中检出的单倍型种类分别有15和22种,当年独有的单倍型分别为4和10种。Hap_10在2020、2021年患者血样中的检出率分别为15.0%(21/140)和3.4%(4/119),差异有统计学意义(χ2=22.264,P<0.05)。不同单倍型的多重突变识别结果显示,4重、5重、6重、7重、9重、10重突变在26种单倍型中的占比分别为0.4%(1/26)、19.2%(5/26)、38.5%(10/26)、30.8%(8/26)、0.4%(1/26)、0.4%(1/26)。中介网络图显示,26种单倍型以单倍型Hap_1为起始,经4重突变(Hap_24),向5重、6重、7重、9重和10重突变逐级进化并远离起始点。结论云南省输入性间日原虫Pvmdr1基因突变存在高度多态性。

云南省输入性及本地感染间日疟原虫裂殖子表面蛋白1基因5区序列的多态性分析

目的分析云南省输入性及本地感染间日疟病例的疟原虫裂殖子表面蛋白1(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1,Pv MSP-1)基因5区序列及其等位基因的多态性。方法 2012年8月-2015年9月,收集云南省输入性及本地感染间日疟病例的滤纸血样和流行病学史等相关信息。提取疟原虫DNA,PCR扩增Pv MSP-1基因5区并测序,与M75674、AAN86237、M60807、ABJ53045、AAN86238、BAA18977等参比序列进行比对,用Mega 5.04、Arlequin3.5.1软件分析Pv MSP-1基因5区的序列多态性,计算序列间保守位点、遗传距离和多样性指数,并根据氨基酸序列间的遗传距离绘制聚类树状图。结果 2012年8月-2015年9月,共收集间日疟病例血样847份。其中,云南省本地感染61份,非洲、缅甸感染的分别为66和720份。847份血样中278份扩增出Pv MSP-1基因5区片段,206份测序成功。Pv MSP-1基因5区片段编码氨基酸长193~222 aa。氨基酸序列比对分析显示,Sal-1、Belem和Recombine基因型分别占59.2%(122/206)、23.3%(48/206)和17.5%(36/206),缅甸、非洲感染和云南本地感染血样中Sal-1基因型分别占58.8%(104/177)、11/15和7/14。Sal-1、Belem、Recombine基因型分别有51、9和6个亚型。这66个亚型的Shannon-wiener指数(H’)和期望杂合度(He)分别为0.955和0.567。206条DNA序列的同源位点为665 bp、保守位点为11.3%(75/665)、变异位点为88.7%(590/665),不同感染来源地的分离株与不同的氨基酸参比序列的遗传距离均小于0.4。聚类分析显示,206条Pv MSP-1基因5区氨基酸序列按基因型聚类成2个大类,有3个次级分支,其中,Recombine与Belem基因型的相似度为91%~92%,高于与Sal-1基因型的82%~83%。结论云南省输入性及本地感染的间日疟原虫分离株Pv MSP-1基因5区存在多种亚型,在Sal-1、Belem、Recombine等3种基因型中,Sal-1型占优势。

云南省不同感染来源间日疟原虫环子孢子蛋白基因多态和种群结构分析

目的分析云南省不同感染来源间日疟原虫环子孢子蛋白(Pvcsp)基因序列,揭示当地Pvcsp基因的种群结构和遗传多样性。方法收集中国疾病预防控制中心传染病网络直报系统中2014-2017年报告的云南省本地和输入性间日疟病例流行病学资料及血样。提取血样中疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增并测序。采用MEGA 5.04、Arlequin 3.5.2.2软件进行单倍型、期望杂合度(He)分析,DnaSP 5.10计算核苷酸多样性(TT)、同义置换率(Ks)、错义置换率(Ka)及群体间遗传分化指数(Fst)。结果共检测间日疟病例血样969份,扩增获得650~750 bp大小的目的条带759份,包括云南本地感染者血样39份、非洲16份、缅甸688份、老挝13份、柬埔寨2份、巴基斯坦1份。单倍型分析结果显示,759条Pvcsp基因序列存在90个单倍型,其中29个为PV-I型温带族(类似VK210型),50个为PV-Ⅰ型热带族(类似VK210型),11个为PV-Ⅱ型(类似VK247型);3种基因型所占比例分别为51.4%(390/759)、41.1%(312/759)、7.5%(57/759),分布于云南本地感染、缅甸输入性病例中,但非洲、老挝及其他地区的输入性病例只表现为PV-Ⅰ型。PV-Ⅰ型、PV-Ⅱ型氨基酸序列突变分别发生在29、10个位点。759份病例血样的He为0.224,π为0.075,Ka/Ks为0.48。除去柬埔寨和巴基斯坦,Pvcsp基因在老挝输入性病例中的遗传多样性最高(He=0.422,π=0.03),云南本地与非洲输入性病例中的遗传分化最高(Fst=0.082),与缅甸输入性病例的遗传分化最低(Fst=0.002);Pvcsp基因在非洲与东南亚地区输入病例中属中等程度的遗传分化,在东南亚地区输入病例中遗传分化很小。结论云南省不同感染来源间日疟原虫环子孢子蛋白基因存在3种基因型,以PV-Ⅰ型温带族为优势虫株,不同基因型的种群结构和遗传分化不同。

间日疟原虫入侵红细胞的相关蛋白研究进展

基于疟原虫入侵途径的多样化以及红细胞表面受体的多样性,间日疟原虫入侵红细胞的过程呈现高度的种特异性。寻找参与疟原虫入侵红细胞的相关分子,探索其入侵机制是疟疾研究领域的重点。间日疟原虫全基因组测序的完成,为从分子水平探索间日疟原虫的入侵机制和疟疾候选疫苗的研究提供了新的研究方法。本文通过达菲结合蛋白、网织红细胞结合蛋白、间日疟原虫色氨酸富集抗原等几种重要的入侵蛋白,对间日疟原虫入侵红细胞分子机制的研究进展作一综述。

间日疟原虫入侵网织红细胞相关蛋白的研究进展

间日疟原虫是世界上分布最广泛的疟原虫,也是造成非洲以外地区人群感染疟疾的主要原因。间日疟原虫优先入侵网织红细胞,呈现高度的种特异性。间日疟原虫网织红细胞结合蛋白(PvRBP)家族作为入侵配体,介导了间日疟原虫入侵网织红细胞的新途径,是重要的免疫靶点。其中PvRBP2b与转铁蛋白受体1(TfR1),PvRBP2a与CD98的相互作用对间日疟原虫入侵网织红细胞至关重要。Pvrbp家族具有高度多态性并且可产生免疫逃避,能够增加间日疟入侵的效率和致病的严重程度。随着对间日疟原虫入侵分子机制研究的日益加深,研究产生高滴度抗体的疟疾疫苗将成为有效预防和控制疟疾的关键方法。本文就网织红细胞在间日疟原虫感染中的作用,以及Pv RBP家族在人群产生免疫应答的研究进展作一综述。