合肥地区奶牛源隐孢子虫的分离与鉴定

目的分离合肥地区奶牛源隐孢子虫,并鉴定其种类。方法采集安徽省合肥市某奶牛场285头成年母牛粪样,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测牛粪中隐孢子虫卵囊,并分离纯化隐孢子虫阳性粪样中的卵囊,抽提其基因组DNA作为模板,根据隐孢子虫18S rRNA和HSP70基因设计引物,用PCR和巢式PCR方法扩增目的片段,对巢式PCR产物进行克隆、测序,并运用DNAStar软件对序列进行同源性比对,构建系统进化树。结果两种方法检测均为阳性的粪样有5份,感染率为1.8%(5/285)。隐孢子虫卵囊呈椭圆或卵圆形,饱和蔗糖溶液漂浮法分离的隐孢子虫卵囊大小为7.37μm×6.13μm,形状指数(长/宽)为1.20;改良抗酸染色法检获的隐孢子虫卵囊大小为7.58μm×6.20μm,形状指数为1.22。巢式PCR扩增出的18S rRNA和HSP70基因片段分别为250 bp和325 bp。合肥奶牛源隐孢子虫5株分离株18S rRNA基因与安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)DQ989573序列一致性最高,两者在系统进化树上为同一分支。这5株分离株的HSP70基因序列与安氏隐孢子虫AY954892和DQ989576序列一致性最高,且在系统进化树上为同一分支。结论合肥市某奶牛场分离的奶牛源隐孢子虫为安氏隐孢子虫。

广西在校大学生人芽囊原虫分离株基因型的初步研究

为了解广西在校大学生人芽囊原虫分离株基因型构成,于2012年收集53例广西医科大学人芽囊原虫感染者粪便,分离虫体,经体外培养后抽提基因组DNA,用已知的7对STS引物进行PCR扩增。结果显示,53株人芽囊原虫分离株中共发现5种已知基因型。其中,1型(351 bp)4株,占7.6%;3型(526 bp)17株,占32.1%;4型(338 bp)4株,占7.6%;6型(317 bp)1株,占1.9%;7型(487 bp)5株,占9.4%。未见基因2型、5型和混合基因型。22株无特异性条带出现,初步认定为未知基因型。

广西10例人芽囊原虫基因型和同工酶谱的研究

目的分析广西10个人芽囊原虫(Blastocystis hominis)分离株基因型,及其乳酸脱氢酶(LDH)和酯酶(EST)的同工酶谱特征。方法从感染者粪便中分离到的10个人芽囊原虫(BhGX1～BhGX10),体外培养并提取基因组DNA。用已知的7对特异性序列标记位点(sequene tagged sites,STS)引物PCR扩增,来鉴定基因型。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),分别进行乳酸脱氢酶和酯酶2种同工酶染色,比较分析10个分离株的酶谱。结果 10个人芽囊原虫分离株中有8个为基因Ⅰ型;另外2个分离株(BhGX4和BhGX7)经7对引物扩增均为阴性,为未知基因型。10个人芽囊原虫分离株在LDH谱中共出现10条酶带,常见酶带为Rm37、Rm49、Rm57、Rm68和Rm92;在EST谱中共出现12条酶带,其中Rm14、Rm18、Rm23、Rm27、Rm45、Rm50和Rm77酶带较常见。各分离株之间的LDH和EST同工酶谱均存在差异。结论广西10个人芽囊原虫分离株以基因Ⅰ型为主,但各分离株之间的LDH和EST同工酶谱存在差异。

巴马瑶族自治县人芽囊原虫感染情况调查

为了解桂西北地区巴马瑶族自治县不同人群人芽囊原虫感染情况,于2011年12月随机抽取巴马瑶族自治县5个行政村(巴马镇盘当村、凤凰乡德纳村、西山乡福厚村、燕洞乡龙威村和甲篆乡兴仁村)为调查点,收集当地居民的新鲜粪便497份,采用改良酸醚离心沉淀法,镜检定性诊断,分析不同调查点、性别、职业、年龄和民族人群芽囊原虫感染情况。结果显示,调查的497人中,人芽囊原虫感染者215例,总感染率为43.3%(215/497)。不同调查点中,巴马镇盘当村的感染率最高,达55.7%(68/122),明显高于其它行政村(P<0.05),其余4行政村的感染率间差异无统计学意义(P>0.05);不同性别、职业、年龄和民族间的感染率差别均无统计学意义(P>0.05)。

左旋精氨酸通过活化树突状细胞增强约氏疟原虫感染DBA/2小鼠的Th1应答效应

目的探讨左旋精氨酸(L-Arginine,L-Arg)对致死型约氏疟原虫(Plasmodium yoelii 17XL,P.y17XL)感染DBA/2小鼠Th1免疫应答的调节效应。方法 DBA/2小鼠随机分为两组,对照组和L-Arg组,每组20只,分别给予DBA/2小鼠生理盐水和L-Arg(1.5g/kg)连续灌胃预处理7d后,每鼠经腹腔感染1×10~6个P.y17XL寄生的红细胞(pRBC)。统计两组小鼠红细胞感染率和小鼠存活率。感染后第0、3和5天每组分别处死4只小鼠,取脾组织制备脾细胞悬液,流式细胞术检测CD4^+CD69^+T细胞、F4/80^+CD36^+巨噬细胞、髓样树突状细胞mDCs(CD11c^+CD11b^+)、浆样树突状细胞pDCs(CD11c^+B220^+)数量,ELISA法检测脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)的分泌水平,Griess反应检测脾细胞培养上清中一氧化氮(NO)含量。结果与对照组(45%)比较,L-Arg组小鼠的最高红细胞感染率降到20%,自愈时间从22d缩短到20d。感染后第3天,L-Arg组小鼠CD4^+CD69^+T细胞数量[(11.27±0.97)%]、IFN-γ分泌水平[(767.86±20.56)pg/ml]、F4/80^+CD36^+巨噬细胞数量[(36.46±1.33)%]、NO产生水平[(78.66±2.89)μmol/L]、mDCs和pDCs数量[(10.02±0.37)%和(9.01±0.53)%]均显著高于对照组[分别为(7.3±0.68)%、(485.84±39.31)pg/ml、(29.61±0.47)%、(42.51±1.32)μmol/L]、(5.51±0.87)%和(5.60±0.85)%](P<0.05),而感染后第5天均无明显差异。结论 L-Arg预处理可促进DCs的活化,从而促进DBA/2小鼠于感染早期Th1免疫应答进一步有效建立。

大蒜素和阿奇霉素治疗隐孢子虫感染小鼠的效果观察

将70只昆明小鼠分为4组,健康对照组(10只)、感染对照组(20只)、大蒜素治疗组(20只)和阿奇霉素治疗组(20只)。两治疗组小鼠于感染隐孢子虫后分别灌胃大蒜素1.5 mg/d或阿奇霉素2 mg/d(均溶于1 ml生理盐水中),连续12 d。用药期间密切观察各组小鼠症状,每日计数粪便中卵囊数量。治疗结束后剖杀各组小鼠,测定空肠近端肠液分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,同时HE染色观察空肠近端肠黏膜病理变化。结果两治疗组小鼠卵囊排出数量,在用药后第5天明显减少并逐渐下降,与感染对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);小鼠肠液sIgA水平测定结果显示,大蒜素治疗组(5.16μl/ml)和阿奇霉素治疗组(3.7μl/ml)之间,差异有统计学意义(P<0.05),两治疗组较感染对照组(2.89μl/ml)明显升高(P<0.05);肠黏膜病理变化观察结果显示,感染对照组小鼠病变较重,肠黏膜充血、水肿,局部可见局灶性坏死。两治疗组仅可见少量炎细胞浸润,病变较轻。可见大蒜素和阿奇霉素对治疗隐孢子虫感染小鼠均具有一定效果,大蒜素对提高肠黏膜局部防御力效果明显。

体外观察一氧化氮对约氏疟原虫雄配子形成的影响

目的体外观察一氧化氮(NO)对疟原虫雄配子形成的影响。方法约氏疟原虫感染DBA/2小鼠,制备薄血膜吉氏(Giemsa)染色观察小鼠原虫血症和配子体血症水平。并通过Griess反应检测脾细胞产生的NO水平。感染第4天,实验组小鼠注射不同剂量的一氧化氮发生剂(NOC5),对照组小鼠注射NOC5前体物质,分别采集其注射前、注射后30min和60min的尾静脉血;感染第6天,实验组小鼠注射一氧化氮合酶抑制剂(L-NMMA),对照组小鼠分别注射D-NMMA和PBS,分别采集其注射前、注射后4h和8h的尾静脉血。体外培养采集的血液,观察雄配子形成。结果感染后第4天和第6天,小鼠脾细胞合成NO水平分别为16.5mmol/L和30.4mmol/L,而雄配子形成数分别为11.33和0.66;感染第4天小鼠注射1mgNOC5后30min和60min的雄配子形成数分别为5.33和2.66,显著低于其对照组(P<0.01);感染第6天小鼠注射L-NMMA后8h的雄配子形成数为1.83,显著高于其对照组(P<0.01)。结论NO可直接抑制疟原虫雄配子形成,是导致疟疾自然传播阻断现象发生的主要效应分子。

补体成分Ficolin-A抗小鼠感染伯氏疟原虫的研究

目的探讨免疫系统补体成分Ficolin-A抗伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)感染的效果。方法克隆扩增伯氏疟原虫裂殖子表面蛋白MSP119基因,构建pGEX-KG-MSP119质粒。将pGEX-KG-Ficolin-A质粒和pGEXKG-MSP119质粒分别转染至大肠埃希菌(E.coli)BL21,1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B柱纯化重组蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)鉴定蛋白表达情况。40只小鼠随机均分为5组,Ficolin-A蛋白组和MSP119蛋白组小鼠每次注射蛋白20μg,MSP119蛋白+Ficolin-A蛋白组小鼠每次注射2种蛋白各20μg,PBS对照组和GST对照组小鼠每次各注射PBS 200μl和GST 20μg,各组小鼠每2周免疫1次,共免疫4次。末次免疫后2周,各组小鼠腹腔注射感染伯氏疟原虫的红细胞300μl,分别于注射感染后第2、4、6、8和10天每组各取3只小鼠,尾静脉采血涂片,吉氏染色后,显微镜下计数感染的红细胞,计算疟原虫密度。感染疟原虫后第20天统计各组小鼠的存活数量。结果测序结果表明,pGEX-KG-Ficolin-A和pGEX-KG-MSP119质粒构建成功。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,Ficolin-A融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为69 000,MSP119融合蛋白约Mr41 000,均与预测值相符。动物实验结果显示,感染后第2、4、6、8和10天,MSP119蛋白+Ficolin-A蛋白组小鼠的疟原虫密度均略低于其他4组,至感染后第10天,疟原虫密度为(22.2±1.7)%,略低于MSP119蛋白组[(33.4±2.7)%]、Ficolin-A蛋白组[(36.2±3.1)%]、GST对照组[(43.8±4.8)%]和PBS对照组[(45.3±3.6)%],但差异均无统计学意义(P>0.05)。感染后第20天,PBS对照组8只小鼠均死亡,Ficolin-A蛋白组存活小鼠数量(3只)与GST对照组(2只)比较,差异无统计学意义(P>0.05);MSP119蛋白+Ficolin-A蛋白组存活小鼠数量(6只)显著高于GST对照组(P<0.05)。结论补体成分Ficolin-A对降低小鼠疟原虫密度效果不明显,联合MSP119使用可提高小鼠感染疟原虫后的生存机会。

河南省输入性卵形疟原虫2个亚种富色氨酸抗原基因的多态性分析

目的分析河南省2015年输入性卵形疟原虫富色氨酸抗原(Plasmodium ovale tryptophan-rich antigen,Po TRA)基因序列。方法采集河南省2015年22例输入性卵形疟患者的血样,收集患者相关信息。提取血样DNA,用巢式PCR方法扩增Po TRA基因,连接至p MD18-T载体,提取质粒进行测序,在Gen Bank中进行同源性比对,判断卵形疟原虫的亚种,并对其基因长度及种类进行分析。对Po TRA基因的氨基酸序列进行比对,分析氨基酸的差异。用邻接法构建系统进化树,分析样本间的亲缘关系。结果 22例卵形疟中,8例为卵形疟原虫wallikeri亚种(P.ovale wallikeri),占36.4%,Po TRA基因长度有245和299 bp 2种类型,以245 bp为主;14例为卵形疟原虫curtisi亚种(P.ovale curtisi),占63.6%,Po TRA基因长度有299、317和335 bp等3种类型,以299 bp为主。氨基酸序列比对显示,wallikeri亚种的2种基因类型相差2个氨基酸单元(MANPINMANPIN和AITPIN),curtisi亚种的3种基因类型间相差2个氨基酸单元(TITPIS和TINPIN)。系统进化树显示,22例样本分为curtisi和wallikeri 2个亚群,其中curtisi亚群又分为2个亚支,299 bp的样本在同一亚支内,317和335 bp的样本在另一亚支内,亲缘关系更近。结论 2015年河南省输入性卵形疟有curtisi和wallikeri 2个亚种,其Po TRA基因存在多态性,curtisi亚种有3种基因类型,wallikeri亚种有2种基因类型。

约氏疟原虫感染小鼠树突状细胞对Th17分化和功能的调控作用

目的探讨约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)17XL株(Py17XL)感染小鼠过程中树突状细胞(DCs)对辅助性T细胞17型(Thl7)细胞分化和功能的调控作用及机制。方法将12只雌性BALB/c小鼠随机分为感染组(Py17XL)、Toll样受体4(TLR4)阻断组(Py17XL+TLR4)、Toll样受体9(TLR9)阻断组(Py17XL+TLR9)和TLR4联合TLR9阻断组(Py17XL+TLR4+TLR9),每组3只。感染前1 d,腹腔注射10μg抗-TLR4单抗(TLR4阻断组)或50μg抗-TLR9单抗(TLR9阻断组)阻断DCs的功能,注射体积为0.4 ml,对照组注射等量的PBS。4组小鼠均腹腔注射1×10~6 Py17XL感染的红细胞。感染后第0、3和5天计数红细胞感染率,同时制备脾细胞悬液,流式细胞仪检测脾脏细胞中CD11c+TLR9+和Th17细胞数量变化,ELISA检测脾细胞培养上清中干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-10(IL-10)水平的变化。结果流式细胞仪检测表明,DCs阻断模型构建成功。感染后第5天,感染组、TLR4阻断组、TLR9阻断组和TLR4联合TLR9阻断组小鼠原虫血症分别为28.0%、29.0%、31.0%和16.3%;感染后第7天,原虫血症分别为43.3%、47.5%、32.5%和8.0%,感染组和TLR4阻断组小鼠全部死亡,其余阻断组小鼠于感染后第6天开始出现死亡。与感染组比较,TLR9阻断组和TLR4联合TLR9阻断组小鼠原虫血症上升缓慢,生存期明显延长至11 d和15 d。流式细胞仪检测结果显示:感染后第5天,TLR9阻断组和TLR4联合TLR9阻断组Th17细胞数量分别为1.2%和1.4%,与感染组(1.9%)相比,数量明显减少(P<0.05,P<0.01)。ELISA检测结果显示:感染后第5天,TLR4联合TLR9阻断组小鼠IFN-γ和IL-10水平分别为(232.4±15.5)pg/ml和(1 791.2±58.2)pg/ml,与感染组[(90.7±50.1)pg/ml和(962.6±409.0)pg/ml]相比,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 Py17XL感染小鼠过程中DCs调控了Thl7细胞的分化和功能。DCs阻断(Py17XL+TLR4+TLR9)后,感染小鼠原虫血症降低,生存期延长。

伯氏疟原虫静息巯基氧化酶的生物信息学分析和体外酶活检测

目的克隆、表达伯氏疟原虫静息巯基氧化酶(PbQSOX)基因,纯化重组Pb QSOX蛋白(rPbQSOX),并对其生物信息学特点和酶活性进行分析。方法分别采用BLAST、SMART、ClustalW对P QSOX蛋白的信号肽、蛋白结构域、活性位点、同源性进行分析;通过BLAST和MAGA5构建PbQSOX的系统进化树;应用SWISS-MODEL对PbQSOX蛋白的三级结构进行预测。BALB/c雌性小鼠经腹腔感染伯氏疟原虫(1×10^7/鼠),于感染后第4天提取疟原虫基因组DNA。PCR扩增PbQSOX基因,经测序正确后,将目的片段连接至原核表达载体pET30a(+),构建重组质粒pET30a(+)-PbQSOX。将鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,取菌液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析;应用镍氨三乙酸琼脂糖柱纯化可溶性的rPbQSOX,并以三(2-羧乙基)膦(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)为酶反应底物分析rPbQSOX的酶活性。P QSOX大部分其他物种的同源基因。多序列蛋白比对与蛋白结构域分析结果显示,PbQSOX蛋白含1个信号肽,存在Trx1、ψErv和Erv/ALR结构域,但完全缺失了Trx2结构域。Pb QSOX蛋白含3个关键的CXXC活化基序(C为半胱氨酸Cys,X为任意氨基酸),即CPAC、CRNC和CNYC;采用MAGA5邻接法构建的系统进化树显示,PbQSOX与约氏疟原虫QSOX(PyQSOX)的亲缘关系最近;SWISS-MODEL同源建模法分析结果显示,用已知的布氏锥虫QSOX(TbQSOX)可预测PbQSOX蛋白的三级结构。PCR扩增PbQSOX基因,获得1486 bp目的条带,经测序为PbQSOX基因序列;pET30a(+)-PbQSOX质粒经NdeⅠ、HindⅢ双酶切与测序鉴定正确。SDS-PAGE和Western bloting分析结果显示,rPbQSOX重组蛋白主要以可溶形式表达,相对分子质量约59000。纯化后的rPbQSOX对TCEP的催化活性为0.84±0.18,DTT的催化活性为0.78±0.14(P<0.01)。结论PbQSOX蛋白为单Trx1结构域的伯氏疟原虫静息巯基氧化酶,构建、表达的rPbQSOX蛋白为可溶性蛋白,具有一定的静息巯基氧化酶催化活性。

约氏疟原虫红内期体外培养的研究

约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)红内期的体外连续培养尚未取得理想的效果。本研究在Trager等体外培养恶性疟原虫方法的基础上,对培养条件进行改进:将约氏疟原虫放在悬液系统培养仪的小室内,使用磁性搅拌器搅拌成悬液;每天更换培养基并向培养基中添加新的网织红细胞;37℃、5% CO_2培养箱内常规培养。每日取体外培养物尾静脉注射小鼠,第3天检查小鼠体内疟原虫感染情况。结果显示,体外培养的24 h内,约氏疟原虫的原虫率增长至2.200%,呈小幅增长,但随后开始下降。第10天,未发现被感染的红细胞。第1~9天的体外培养物感染的小鼠均呈阳性,且第10天的体外培养物感染小鼠呈阴性。第1天体外培养物感染小鼠的原虫率最高,为54.960%。说明约氏疟原虫红内期的体外培养可以维持9 d,且体外培养的约氏疟原虫具有感染力。

瘦素蛋白转基因约氏疟原虫对小鼠体质量的影响

目的探讨含瘦素(leptin)蛋白转基因约氏疟原虫(Plasmodium yoelli)对感染小鼠体质量的影响。方法设计并构建含小鼠瘦素基因的疟原虫CRISPR/Cas9重组质粒,该质粒两端带有约氏疟原虫17XNL株巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的5′和3′同源序列,将外源的小鼠瘦素基因经同源重组插入至MIF基因编码区下游,构建重组质粒PYC-MIF-Leptin。将该重组质粒电转入体外培养的约氏疟原虫成熟裂殖体内,通过尾静脉注射该裂殖体感染雌性昆明小鼠1只,经乙胺嘧啶筛选和PCR鉴定获得转基因约氏疟原虫克隆。将转基因疟原虫和野生型疟原虫感染C57BL/6小鼠各1只,取眼球血和尾静脉血,通过RTPCR和免疫荧光检测瘦素在疟原虫内是否成功表达。将含转基因疟原虫和野生型疟原虫(1×104接种量)的200μl PBS尾静脉注射感染C57BL/6小鼠各5只,阴性对照组注射等量PBS。每两天记录并统计小鼠原虫血症及体质量变化。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。结果构建了含瘦素基因和疟原虫MIF同源重组序列的重组质粒PYC-MIF-Leptin。转基因疟原虫DNA测序结果证实,瘦素基因整合入MIF基因下游,并在疟原虫中成功转录。免疫荧光实验结果表明,转基因疟原虫能够表达小鼠瘦素蛋白。转基因疟原虫组17 d体质量下降尤其明显,为(17.26±1.40)g。野生型疟原虫组和阴性对照组小鼠体质量无明显变化,而转基因疟原虫组体质量下降达10.7%(P<0.05)。两种疟原虫都在原虫血症达到10%左右时开始下降,但是转基因疟原虫增殖速度较快,最终在23 d左右均消失。结论表达瘦素基因的转基因约氏疟原虫可降低感染小鼠的体质量。

卵形疟原虫非洲分离株K13基因的多态性分析

目的分析卵形疟原虫柯氏亚种(Plasmodium ovale curtisi)和沃氏亚种(P. ovale wallikeri)非洲分离株K13蛋白编码基因的多态性,为卵形疟原虫青蒿素抗性监测提供科学依据。方法收集江苏省2012-2016年卵形疟患者血样,经流行病学调查确认为非洲输入性卵形疟病例。提取血样DNA,通过实时荧光PCR探针法鉴别卵形疟原虫柯氏亚种和沃氏亚种。采用巢式PCR扩增K13基因的结构域并送测序,以卵形疟原虫柯氏亚种参考序列(PlasmoDB登录号:PocGH01_12019400)和沃氏亚种参考序列(GenBank登录号:LT594516.1)为模板,应用BioEdit软件对测序序列进行比对,应用DNAstar软件分析序列的突变情况,用DnaSP软件分析序列多态性,用MEGA软件构建系统进化树。结果 2012-2016年共收集168例卵形疟患者的血样,感染来源地为中非(95例)、南非(37例)、西非(34例)、东非(1例)和北非(1例);卵形疟原虫柯氏亚种和沃氏亚种各84例。168例血样K13基因巢式PCR均扩增获得1 500 bp的条带且均测序成功。卵形疟原虫K13基因核苷酸多样性指数π为0.000 02,单体型多样性指数Hd为0.024, 2个亚种K13基因分别含有2个单体型,分别发现1个单核苷酸多态性位点,各有1例样本检出卵形疟原虫核苷酸碱基突变,柯氏亚种在核苷酸717 bp (氨基酸239E)位点处存在A/G突变,沃氏亚种在核苷酸1998 bp (氨基酸666P)位点处存在T/A突变,均为同义突变,与卵形疟原虫青蒿素耐药性无关。本研究患者血样卵形疟原虫2个亚种K13基因序列中性检验统计结果无明显差异,符合中性进化模型。系统进化树显示,卵形疟原虫柯氏亚种2个单体型聚为一支,沃氏亚种2个单体型聚为另一支。结论卵形疟原虫非洲分离株柯氏亚种和沃氏亚种K13基因未发现非同义突变,其基因多态性水平较低,无青蒿素耐药性相关的基因突变。

伯氏疟原虫对小鼠脾B细胞和自然杀伤细胞及其表面分子的影响

为探讨伯氏疟原虫对小鼠脾B细胞和自然杀伤(NK)细胞及其表面分子的影响,将10只雌性C57BL/6小鼠随机分为健康对照组和感染组,每组5只。感染组小鼠经尾静脉注射伯氏疟原虫(106个/鼠)进行感染,健康对照组注射等量生理盐水。感染后6 d,取小鼠脾,制备单细胞悬液,采用流式细胞术检测小鼠B细胞和NK细胞的含量及其表面分子CD62L、CXCR3、CD69的表达水平。结果显示,感染组小鼠脾B细胞百分比含量为(79.2±3.6)%,高于健康对照组的(54.3±4.4)%(P<0.01);感染组脾NK细胞百分比为(2.2±0.7)%,低于健康对照组的(4.6±0.8)%(P<0.01)。CD62L在感染组B细胞中的百分比为(77.7±4.4)%,高于健康对照组的(72.8±7.1)%,但二者差异无统计学意义(P>0.05);CD62L在感染组NK细胞中的百分比为(61.9±4.8)%,低于健康对照组的(86.6±4.2)%(P<0.01)。CXCR3在感染组B细胞中的百分比为(4.1±0.1)%,高于健康对照组的(3.0±0.2)%(P<0.01);CXCR3在感染组NK细胞中的百分比为(2.1±0.9)%,低于健康对照组的(2.3±0.4)%,但二者差异无统计学意义(P>0.05)。CD69在感染组B细胞和NK细胞中的百分比分别为(54.3±4.7)%、(22.2±1.6)%,均高于健康对照组的(1.9±0.4)%、(1.3±0.3)%(P<0.01)。提示感染疟原虫的小鼠可能通过增加B细胞的数量以及上调其表面分子CXCR3和CD69及NK细胞表面分子CD69的表达水平发挥抗疟作用。

高剂量氯磷酸脂质体处理对小鼠体内约氏疟原虫生长的影响及机制初探

目的探究高剂量氯磷酸脂质体(CL)处理对小鼠体内约氏疟原虫17XL(Py17XL)生长的影响。方法取61只雌性BALB/c小鼠,随机分成5组:高剂量CL处理组(简称CL处理组,23只)和对照脂质体处理组(29只)小鼠分别于感染Py17XL前1 d和感染后2、5 d,尾静脉注射高剂量CL(5μg/μl 200μl)和等量对照脂质体;健康CL处理组(3只)和健康对照脂质体处理组(3只)小鼠在相同时间尾静脉注射高剂量CL(5μg/μl 200μl)和等量对照脂质体;空白对照组(3只)小鼠不作任何处理。于感染后每天采集CL处理组和对照脂质体处理组小鼠(各5只)尾静脉血,涂片后显微镜下观察原虫血症,并统计小鼠存活情况。感染后0、3、6 d,取CL处理组和对照脂质体处理组小鼠(每次3只)脾脏,分离脾淋巴细胞,采用流式细胞术检测两组小鼠疟原虫特异性CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的增殖能力和γ干扰素(IFN-γ)分泌水平,ELISA检测感染后6 d的小鼠血清抗疟原虫Ig G抗体水平。感染后2、4、6 d,取CL处理组、对照脂质体处理组、空白对照组小鼠(每次3只)脾脏,分离脾淋巴细胞,采用流式细胞术检测CL耗竭的细胞种类,吉氏染色后显微镜下观察对照脂质体处理组小鼠(每次2只)脾脏树突状细胞的疟原虫感染情况。结果CL处理组和对照脂质体处理组小鼠均在感染后7 d出现死亡(CL处理组2只,对照脂质体处理组3只),且感染后8 d全部死亡,差异无统计学意义(χ^(2)=0.360,P>0.05)。感染Py17XL后,CL处理组小鼠的原虫血症均低于对照脂质体处理组小鼠,其中感染后6 d,CL处理组小鼠原虫血症为(34.537±8.165)%,与对照脂质体处理组小鼠的(61.303±8.799)%差异有统计学意义(F=1.821,P<0.05)。感染后2、4、6 d,CL处理组小鼠脾脏中的单核细胞(CD11b^(+))占比分别为(6.240±0.605)%、(8.277±0.411)%、(6.573±0.246)%,树突状细胞(CD11c^(+))占比分别为(3.700±0.599)%、(8.003±0.655)%、(3.920±0.534)%,巨噬细胞(F4/80;)占比分别为(4.830±0.695)%、(11.007±1.121)%、(2.743±0.395)%,均低于对应的对照脂质体处理组,且差异有统计学意义(F=5.945、2.075、7.091,P<0.05)。感染后3、6 d,CL处理组与对照脂质体处理组小鼠疟原虫特异性CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞的增殖能力和IFN-γ分泌水平差异均无统计学意义(P>0.05)。感染后6 d,CL处理组小鼠稀释10倍的血清抗疟原虫IgG抗体水平为2.241±0.056,低于对照脂质体处理组的2.490±0.090,差异有统计学意义(F=27.66,P<0.05)。镜检结果显示,感染后2、4 d,对照脂质体处理组小鼠的CD11c^(+)细胞内并未发现疟原虫,绝大多数感染后6 d的CD11c^(+)细胞内发现了大量的疟原虫。结论高剂量CL耗竭巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞后,并非通过调节小鼠抗红内期疟原虫的固有免疫和适应性免疫应答参与抑制Py17XL的增殖和发育。

蛋白激酶9在约氏疟原虫生长发育中的作用

目的探究蛋白激酶9 (PK9)在约氏疟原虫生长发育中的作用。方法基于疟原虫PlasmoDB数据库,查找约氏疟原虫致死株17XL (Py17XL)的PK9序列信息, BLAST比对Py PK9和恶性疟原虫PK9(Pf PK9)以及人蛋白激酶p78的同源性。提取Py17XL株野生型(WT)基因组DNA,设计引物, PCR扩增PK9基因。采用CRISPR-Cas9技术,将同源臂与sgRNA序列一起连接到PYC-MCS质粒中,构建PK9基因敲除(PK9KO)重组质粒。重组质粒电转至Py17XL虫株内,经乙胺嘧啶筛选、克隆,进行PCR鉴定和测序。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT感染组和PK9KO感染组,每组5只,重复3次实验。每鼠腹腔注射1×105个红内期疟原虫,每隔24 h取血检测小鼠原虫血症,观察小鼠存活情况。200只3~5日龄的斯氏按蚊随机分为WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组,每组100只。于吸血8 d后解剖蚊胃,每组随机选取15只斯氏按蚊进行解剖,测定蚊胃中卵囊的数量。10只雌性BALB/c小鼠随机分为WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组,每组5只,重复2次实验。每鼠尾静脉注射1×103个子孢子,每隔12 h取血,涂片观察其原虫血症出现时间。结果Py PK9与Pf PK9的序列一致性为82.5%, Py PK9和人类蛋白激酶p78的一致性为39.4%。PK9基因PCR扩增产物的长度约为597 bp。经PCR鉴定、测序确定PK9KO重组质粒构建成功, Py17XL虫株成功敲除PK9基因。WT感染组小鼠迅速出现原虫血症,感染后5~6 d全部死亡, PK9KO感染组小鼠全部存活,原虫血症在感染后17 d消失。WT感染小鼠吸血组和PK9KO感染小鼠吸血组的斯氏按蚊感染率分别为60.0%(9/15)和66.7%(10/15),差异无统计学意义(P> 0.05)。WT子孢子感染组和PK9KO子孢子感染组小鼠均于72 h查见原虫血症。结论PK9在红内期Py17XL的毒力中发挥了重要作用。