云南三带喙库蚊对DDT和溴氰菊酯的抗药性研究

目的 了解云南省三带喙库蚊对DDT和拟除虫菊酯类的抗药性现状和分布。 方法 选择云南省昭通市昭阳区、德宏州芒市、普洱市江城县和孟连县，以及玉溪市元江县为调查点，采集三带喙库蚊成蚊，采用成蚊滤纸接触筒法，测定其对DDT和溴氰菊酯的敏感性，根据校正死亡率判定抗性级别。 结果 云南昭阳、芒市、江城、孟连和元江的三带喙库蚊暴露DDT 1 h，24 h后的死亡率分别为51.1%、86.8%、35.4%、21.0% 和4.6%，KT50的范围为18.76～395.65 min，除芒市为初步抗性（M）外，其余4地均为抗性（R）；对溴氰菊酯的死亡率分别为36.9%、59.2%、43.1%、34.1% 和3.3%，KT50的范围为8.69～715.37 min，各调查点均为抗性（R）。 结论 云南省从北到南的三带喙库蚊对DDT和溴氰菊酯同时存在抗性，未来在上述地区使用化学杀虫剂的策略应进行调整。

淡色库蚊转铁蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其抑菌活性的初步研究

目的利用毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达具有生物活性的淡色库蚊(Culex pipiens pallens)转铁蛋白(Transferrin,Tsf),并初步研究其抑菌活性。方法 RT-PCR扩增淡色库蚊转铁蛋白的编码基因序列,并克隆至毕赤酵母组成型表达载体pGAPZα-A的α-factor信号肽序列下游,构建pGAPZα-A-Tsf重组分泌表达载体。重组载体经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切和测序正确后,采用BlnⅠ线性化处理,电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞,转化子经Zeocin抗性筛选和菌落PCR构建pGAPZα-A-Tsf/GS115工程菌。重组转铁蛋白表达上清采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析。表达上清经镍-氨三乙酸亲和层析柱(NiNTA)纯化后,磷酸缓冲液(PBS)稀释为1.000、0.500、0.250和0.125 mg/ml,采用琼脂糖扩散抑菌圈法进行抑菌实验。结果 RT-PCR结果显示,转铁蛋白基因片段大小为2 100 bp,与预期结果一致。pGAPZα-A-Tsf重组载体双酶切获得2 127 bp条带,与预期结果一致,测序结果表明其构建成功。菌落PCR结果显示,pGAPZα-A-Tsf/GS115工程菌构建成功。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组转铁蛋白表达了相对分子质量(Mr)约为80 200的蛋白产物,与预期大小一致。Ni-NTA纯化后重组转铁蛋白的抑菌实验表明,添加1.000、0.500、0.250 mg/ml重组转铁蛋白的平板上均有明显的抑菌圈,最低抑菌浓度为0.250 mg/ml。结论淡色库蚊转铁蛋白可通过基因重组方式从毕赤酵母中分泌表达具有抑菌活性的转铁蛋白。

淡色库蚊抗敌敌畏和抗氯氰菊酯品系的抗性演变

本研究采用敌敌畏和氯氰菊酯对淡色库蚊敏感品系进行选育,至第42代,抗敌敌畏和抗氯氰菊酯品系的抗性指数分别为亲代的12.2倍和534.3倍。选育停止后经20代常规饲养,抗敌敌畏和抗氯氰菊酯品系的抗性指数分别降至6.1倍和83.3倍。表明淡色库蚊对敌敌畏和氯氰菊酯抗性形成和下降速度均不相同。

上海崇明发现稻富库蚊(双翅目∶蚊科)的记录

目的记录上海崇明发现稻富库蚊(Culex inatomii)。方法本研究于2015-2016年的5-11月在上海市崇明区东滩采集稻富库蚊的幼虫和成蚊,进行形态学观察。提取成蚊基因组DNA,PCR扩增线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因片段。Clustal W2软件进行COⅠ序列多重比对。采用MEGA v5.10软件计算稻富库蚊与其同属的凶小库蚊(Cx.modestus)、淡色库蚊(Cx.pipiens pallens)和三带喙库蚊(Cx.tritaeniorhynchus)的种内和种间遗传距离。采用邻接法、最大似然法和贝叶斯法构建4个蚊种的系统进化树。结果共采集稻富库蚊成蚊156只,均为雌蚊;捕捞幼虫36只,实验室羽化后获雌蚊17只,雄蚊19只。形态学观察可见,雄蚊尾器结构中,抱肢基节亚端叶毛分为两组,前组具有2根棒状毛,后组具有1根棒状毛和1根叶状毛,可与其近缘种凶小库蚊区分。线粒体COⅠ基因片段PCR扩增获得约650 bp大小的条带,测序后提交Gen Bank(登录号为KX555565~KX555570)。COⅠ序列多重比对结果显示,稻富库蚊和凶小库蚊COⅠ序列的相似度为96%。两者种内遗传距离分别为0.001和0.011,种间遗传距离达0.047。系统进化树结果可见,4个蚊种聚成单系群,每个种独立为1个分支;稻富库蚊与凶小库蚊的亲缘关系最接近,而与同属其他2个蚊种的关系较远。结论上海崇明发现稻富库蚊。

云南省三带喙库蚊对DDT和溴氰菊酯抗性群体的击倒抗性基因突变分析

目的分析经接触DDT和溴氰菊酯敏感性测定的三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)的抗性(存活)与敏感(死亡)表型样本的击倒抗性基因(knockdown resistance,kdr)序列,阐明其抗性表型与kdr基因突变的关系。方法收集云南昭阳、芒市、江城和孟连等地的三带喙库蚊经接触DDT和溴氰菊酯测定后死亡和存活的个体,分别提取单蚊基因组DNA,PCR扩增kdr部分基因片段,测定和分析序列,统计抗性与敏感表型个体中kdr突变的基因型和频率,采用χ~2检验分析kdr基因突变与抗性表型的相互关系。结果共获得411条三带喙库蚊kdr基因序列,检测结果显示,在1014位点存在突变,等位基因有2种,即野生型TTA/L和突变型TTT/F;基因型共3种,分别为野生型纯合子L/L,突变型纯合子F/F,以及野生型/突变型杂合子L/F,频率分别为96.35%(396/411)、0.73%(3/411)和2.92%(12/411)。在接触DDT的抗性与敏感表型个体中,突变基因型频率分别为3.42%(4/117)和3.88%(4/103);在接触溴氰菊酯的抗性与敏感个体中,突变基因型频率为3.96%(4/101)和3.33%(3/90)。接触DDT和溴氰菊酯的三带喙库蚊抗性与敏感表型与kdr基因型频率无相关性(χ~2=0.034,P>0.05;χ~2=0.053,P>0.05)。结论云南省三带喙库蚊中发现kdr新的等位基因L1014F,但频率较低。该蚊对DDT和溴氰菊酯产生抗性与kdr基因突变未见相关性。

淡色库蚊不同发育阶段肠道菌群多样性分析

目的了解淡色库蚊不同发育阶段肠道菌群的组成与多样性。方法取淡色库蚊的Ⅳ龄幼虫、蛹、雌成蚊各20只,分别剖取肠道(每个发育阶段设3个重复),提取肠道细菌基因组DNA,PCR扩增肠道细菌的16S rRNA高变区序列,采用Illumina NovaSeq6000测序平台进行测序。整理统计测得的序列数目和可操作分类单元(OTU),采用群落结构柱状图和Veen图分析淡色库蚊不同发育阶段肠道细菌的群落组成与丰度,采用Alpha多样性指数分析微生物群落的丰度和多样性,采用主坐标分析(PCoA)对不同发育阶段肠道细菌群落结构进行差异分析,采用线性判别分析(LEFSe)揭示组间在丰度上有显著差异的物种,采用SPSS 22.0统计学软件对属水平上不同阶段淡色库蚊核心细菌丰度进行单因素方差分析。结果淡色库蚊Ⅳ龄幼虫、蛹、雌成蚊的肠道菌群共有1972个OTU,归属22门45纲112目178科329属。在属水平上,Ⅳ龄幼虫、蛹和雌成蚊肠道细菌分别由230、233和228个属组成,各发育阶段共有的优势属为拟杆菌属[丰度分别为(16.83+3.5)%、(26.98±0.94)%、(20.82±2.63)%]、Muribaculaceae[丰度分别为(12.36±1.94)%、(19.98±1.24)%、(14.90±1.52)%]、另枝菌属[丰度分别为(4.13±0.62)%、(7.29±1.28)%、(5.36±1.00)%]和毛螺菌科_NK4A136组[丰度分别为(3.39±0.39)%、(5.77±0.21)%、(3.93±0.40)%]。在OTU水平,Veen图分析结果显示,Ⅳ龄幼虫、蛹、雌成蚊共有的OTU数目为687,特有的OTU分别为250、284、309。Alpha多样性显示,不同发育阶段淡色库蚊肠道菌群的组成与多样性存在差异(F=36.83,P<0.01;F=28.91,P<0.01),蛹的物种丰度和物种多样性最高(6.58±0.04)。PCoA结果显示,肠道菌群分为3组,各阶段分别归为1组;各阶段肠道菌群组成差异有统计学意义(Df=2,R^(2)=0.70744,P<0.01)。LEFSe结果显示,共17个分类单元在不同发育阶段具有差异;赖氏菌属、拟杆菌属、Muribaculaceae、沃尔巴克氏体属在淡色库蚊不同发育阶段的丰度差异具有统计学意义(F=48.331、10.826、17.759、95.139,P<0.01),赖氏菌属主要存在于Ⅳ龄幼虫阶段(0.887±0.022),拟杆菌属(0.270±0.009)和Muribaculaceae(0.200±0.012)主要存在于蛹阶段;沃尔巴克氏体属主要存在于雌成蚊阶段(0.172±0.025)。结论淡色库蚊不同发育阶段肠道优势菌群主要为拟杆菌属和Muribaculaceae,蛹的物种丰度和物种多样性最高。