过表达miR-151a-3p抑制PC-3前列腺癌细胞增殖和迁移

目的研究上调微小RNA-151a-3p(miR-151a-3p)对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响和机制。方法采用实时荧光定量PCR检测PC-3M、C4-2B、22RV1、DU-145、PC-3、LNCaP人前列腺癌细胞和RWPE-1人正常前列腺上皮细胞中miR-151a-3p的表达量。以miR-151a-3p表达量最低的PC-3细胞为研究对象,生物信息学预测并采用双荧光素酶报告基因实验检验miR-151a-3p的潜在靶基因。转染miR-151a-3p模拟物或阴性对照微小RNA(miR-NC)至PC-3细胞。实时荧光定量PCR检测miR-151a-3p和潜在靶基因mRNA的表达量,Western blot法检测靶基因及下游信号通路蛋白表达量。采用MTT法检测PC-3细胞的增殖,Transwell^(TM)实验检测PC-3细胞的迁移能力。结果 miR-151a-3p在前列腺癌细胞的表达量明显低于RWPE-1人正常前列腺上皮细胞,其中PC-3细胞中的表达量最低。生物信息学预测及双荧光素酶报告基因实验表明NIMA相关激酶2(NEK2)是miR-151a-3p的潜在靶基因。转染miR-151a-3p模拟物后,PC-3细胞中miR-151a-3p的表达量明显上升,NEK2基因的表达量明显降低,NEK2基因下游磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-mTOR)信号通路蛋白水平降低。上调miR-151a-3p明显抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖和迁移。结论miR-151a-3p在前列腺癌细胞中表达降低,上调miR-151a-3p的表达可通过降低NEK2基因及下游PI3K-AKT-mTOR信号通路蛋白的表达抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖和迁移。

脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2)基因重组原核表达质粒,表达重组蛋白,制备人LP-PLA2多克隆抗体。方法从分化的THP-1细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增LP-PLA2全长编码基因,插入原核表达载体pCold TF中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温(15℃)诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Sepharose 6FF亲和层析及DEAE-Sephadex离子交换层析后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot法检测多抗的反应原性。结果重组表达质粒pCold TF-LP-PLA2经双酶切及测序证实构建正确;TF-LP-PLA2获得可溶性表达,相对分子质量约为93 000;纯化的重组蛋白纯度可达90%,可与市售兔抗人LP-PLA2抗体反应;制备的抗血清效价达1∶5.12×106以上,反应原性良好。结论已成功原核表达了重组LP-PLA2蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为下一步制备单克隆抗体及建立LP-PLA2免疫检测方法奠定了基础。

不同比色方法测定疫苗中游离甲醛残留量的比较

目的比较不同方法测定疫苗中游离甲醛残留量的差异。方法采用不同方法测定0.25～100μg/ml标准甲醛溶液,绘制反应曲线,初步确定各种方法的线性范围,通过重复测定,计算相关系数,对标准曲线的线性范围进行验证;分析制品中铝佐剂、离心及添加物对检测结果的影响,并对方法的适用性进行验证。结果品红亚硫酸法(《中国药典》)的线性范围为25～100μg/ml,改良乙酰丙酮法与乙酰丙酮法(Sinovac)的线性范围为0.25～100μg/ml,乙酰丙酮法(Crucell)、乙酰丙酮法(Pasteur)和盐酸苯肼法(MSD)的线性范围为0.25～50μg/ml,各方法标准曲线的相关系数为0.994～1.000。品红亚硫酸法测定未离心的含铝佐剂样品的回收率在18.06%～76.00%之间,测定离心后的含铝佐剂样品的回收率在17.19%～75.95%之间;乙酰丙酮法测定未离心的含铝佐剂样品的回收率在88.28%～103.21%之间,测定离心后的含铝佐剂样品的回收率在95.43%～102.78%之间;盐酸苯肼法测定未离心的含铝佐剂样品的回收率在99.27%～117.74%之间,测定离心后的含铝佐剂样品的回收率在100.55%～119.40%之间。各方法测定含添加物样品的回收率在94.68%～101.86%之间。改良乙酰丙酮法(412 nm)测定含甲醛疫苗的回收率在100.84%～105.88%之间,变异系数在0.28%～3.08%之间。结论改良乙酰丙酮法操作简便,灵敏度高,线性范围广,结果准确可靠,适用于疫苗中游离甲醛残留量的测定。

首批重组人干扰素α2b活性测定国家标准品的研制

目的研制首批重组人干扰素α2b（rhIFNα2b）活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部（2010版）相关要求,进行rhIFNα2b活性测定标准品的制备、检验,以rhIFNα2b国际标准品为标准进行协作标定,并使用热加速试验进行稳定性考察。结果制备的rhIFNα2b活性测定标准品外观、无菌检查合格,水分含量为0.6%,分装精度为0.3%;经5个实验室协作标定共25次,几何平均生物学活性为4.27×105 IU/支,平均生物学活性的95%置信区间为4.13×105-4.42×105 IU/支,单次测定的95%参考值范围为3.65×105-5.00×105 IU/支,平均可信限率为3.32%;在-20℃下,生物学活性降低10%需19.6年,稳定性较高。结论该批rhIFNα2b活性测定标准品各项指标均符合《中国药典》三部（2010版）相关要求,已被批准为国家标准品,规格为：4.27×105 IU/支。

首批黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品的研制

目的制备我国首批黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品。方法委托北京天坛生物制品股份有限公司制备1批经全面检验合格的黄热减毒活疫苗作为候选国家标准品(批号为:20111201)。由3家实验室采用空斑法对黄热减毒活疫苗病毒滴度标准品进行协作标定,以黄热病疫苗国际标准品为溯源,确定本国家标准品以LgIU/ml为标示单位的病毒滴度,并分析标准品的分装精度、稳定性、均匀性。结果制备的国家标准品分装精度为-0.68%~0.95%。3家实验室20次协作标定结果显示,标准品病毒滴度的IU赋值为5.4 LgIU/ml。37℃2周加速破坏试验病毒滴度下降0.5 LgPFU/ml;长期稳定性考察(-30℃),病毒滴度2年内下降0.5 LgPFU/ml,而第3、4年病毒滴度基本无下降。均匀性参考量值——pH的CV值为0.17%、卵清蛋白含量的CV值为4.4%,病毒滴度CV值为2.0%。结论研制的黄热减毒活疫苗病毒滴度国家标准品符合国家标准品要求,可作为国家标准品进行发放和使用。该国家标准品批准文号为(2016)国生标字0032,其批号编码为250017-20111201。

丙型肝炎病毒人源单克隆抗体的初步筛选

目的构建天然人源噬菌体抗体库,初步筛选人源抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)多肽抗原的单克隆重组噬菌体抗体。方法以健康成人外周血淋巴细胞cDNA为模板,采用PCR技术扩增轻(VL)、重链(VH)可变区基因;重叠PCR法拼接生成单链抗体可变区基因片段(single chain fragment variable,scFv),并克隆至噬菌体载体p CANTAB5e,得到初级抗体库;使用HCV多肽混合抗原,经3轮淘筛富集噬菌体抗体;Phage ELISA法初步筛选HCV重组噬菌体抗体。结果成功构建了天然人源噬菌体抗体库。scFv(VH-κ)库的库容为6.0×10~7 PFU/mL,scFv(VH-λ)库的库容为4.28×10~9 PFU/m L;经初步淘筛,成功获得HCV三级抗体库;Phage ELISA得到了3株候选重组噬菌体抗体。结论初步得到HCV多肽抗原重组噬菌体抗体,为今后进一步筛选高亲和力噬菌体抗体和可溶抗体奠定了基础。