人ICOS-Ig融合蛋白的真核表达及其生物学活性

目的:真核表达人ICOS胞外区与IgGFc融合蛋白,并对其生物学活性进行初步分析。方法:以RT-PCR方法克隆人ICOS胞外区片段和人IgGFc片段,定向插入真核表达载体pSecTag2,构建重组质粒pSecTag2-ICOS-Ig,脂质体转染CHO细胞,可溶性表达并纯化ICOS-Ig融合蛋白。采用SDS-PAGE、蛋白质印迹、ELISA对融合蛋白进行鉴定,配体结合活性实验和混合淋巴细胞增殖反应实验检测融合蛋白的活性。结果:构建的ICOS-Ig融合蛋白表达载体在CHO细胞中表达ICOS-Ig蛋白。纯化获得的ICOS-Ig可以与配体ICOSL特异性结合,并抑制同种T淋巴细胞增殖反应。结论:成功构建了人ICOS胞外区与人IgGFc融合蛋白真核表达系统,获得有生物学活性的ICOS-Ig融合蛋白。

布鲁杆菌Cu-Zn SOD和GroEL的克隆表达及细胞免疫特性比较分析

目的分析比较布鲁杆菌两种外膜蛋白Cu-Zn SOD和GroEL的细胞免疫特性。方法以布鲁杆菌16M基因组为模板,PCR扩增Cu-Zn SOD和GroEL蛋白的基因序列。采用Gateway方法构建表达载体,在大肠埃希菌中诱导表达并纯化,用获得的纯化蛋白刺激减毒活疫苗S19免疫小鼠的脾细胞,并测定细胞上清中IFN-γ的水平。结果成功克隆表达了Cu-Zn SOD和GroEL蛋白,用这两种蛋白刺激S19免疫小鼠脾细胞后,细胞上清中的IFN-γ水平明显升高,并且GroEL刺激后的IFN-γ水平高于Cu-Zn SOD刺激后的IFN-γ水平。结论 GroEL和Cu-Zn SOD蛋白均具有细胞免疫反应特性,且GroEL的细胞免疫反应特性强于Cu-ZnSOD。

基于转录介导扩增技术的新一代核酸检测试剂的多中心评估

目的通过在多个血液中心开展Procleix Ultrio Plus(Ultrio Plus)试剂对献血者样品进行单人份检测和混样检测,评估Ultrio Plus检测试剂的敏感性和临床特异性。方法对深圳市血液中心(SZBC)和天津市血液中心(TJBC)献血者共12 131例进行单人份检测(IDT),福建省血液中心(FJBC)共16 416份样品进行16人混样(P16)检测,使用Ultrio Plus试剂检测样本HBV、HIV-1、HCV,将结果与常规血清学和核酸检测Procleix Ultrio(Ultrio)结果进行比较,对检测结果不一致的样本采用取血浆袋样本进行补充实验和Alt-NAT检测进行结果判定;对判定为HBV DNA真阳性的样本60例进行稀释,分别采用Ultrio Plus和Ultrio检测比较两种试剂的敏感性。结果在IDT检测模式下,Ultrio Plus试剂在血清学阴性样品中的HBV DNA检出率为0.148%(1/674),相比Ultrio提高了3倍(0.148%vs 0.049%);在P16检测模式下,Ultrio Plus的HBV DNA单独检出率为0.12%(1/864)。Ultrio Plus对HBV DNA真阳性样本稀释品的检出率也高于Ultrio,差异有统计学意义。结论在HBV DNA检测方面,Ultrio Plus较Ultrio具有更高的敏感性。在HBV高发区,采用Ultrio Plus IDT模式在成本控制和效率上可能是最优的检测策略。

稳定表达可诱导共刺激分子CHO细胞株的筛选及其生物学活性鉴定

目的:构建携带人可诱导共刺激分子(inducible costimulator molecule,ICOS)基因的重组逆转录病毒载体,筛选稳定表达ICOS蛋白的CHO细胞株,并对其生物学活性进行鉴定。方法:RT-PCR法从人PBMC中获取ICOScDNA,定向克隆到逆转录病毒载体上,制备逆转录病毒重组体pMSCV-ICOS;经病毒包装细胞包装后抗性筛选出产高滴度病毒的细胞株,用高滴度病毒上清感染CHO细胞,抗性筛选出稳定表达细胞株。将CHO-ICOS细胞和PBMC以不同比例(1:1、1:2、1:5、1:10)共培养,加入亚刺激剂量(200ng/ml)的抗人CD3抗体,采用3H-TdR掺入法检测PBMC的增殖,流式细胞仪检测T细胞表面活化分子CD25表达情况,并以CHO-pMSCV细胞和PBMC以1:1比例共培养作为阴性对照以及未处理的PBMC作为空白对照。结果:成功构建逆转录病毒重组体pMSCV-ICOS,筛选出稳定表达ICOS蛋白的CHO细胞株。3H-TdR掺入法和流式细胞仪检测结果表明,与阴性对照及空白对照相比,CHO-ICOS细胞与PBMC共培养能抑制CD3抗体诱导的PBMC增殖及活化(P<0.05或P<0.01),细胞比例为1:1时抑制率最大,分别为(68±5.9)%、(44.08±3.26)%。结论:成功建立具有生物学活性的膜稳定表达人ICOS蛋白的CHO细胞株,为今后研究奠定了基础。

可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白的理化性质和体内生物学活性分析

目的对自行研制的可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白的理化性质和体内生物学活性进行分析鉴定。方法采用HCl水解法、Edman法、胰酶消化MALDI-TOF-MS质谱法分别测定该融合蛋白的氨基酸组成、N末端15个氨基酸序列、肽谱等理化性质,并通过CFSE标记体内检测淋巴细胞增殖反应实验研究其抑制同种淋巴细胞增殖的生物学活性。结果氨基酸组成分析测得样品的氨基酸组成与ICOS-Ig理论值基本一致。蛋白N末端15个氨基酸序列为EINGSANYEM-FIFHN,与ICOS-Ig理论值一致。MALDI-TOF-MS质谱测定共获得6个与理论预测值相符的肽段。ICOS-Ig可以明显抑制同种T细胞的体内增殖反应。结论所研制的可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白结构表达正确且具有体内抑制同种淋巴细胞增殖的活性,为该融合蛋白的质量标准研究奠定了基础。

脐血红细胞CD35调控白细胞CXCR4表达能力的变化

目的探讨脐血红细胞调控白细胞CXCR4表达能力的变化。方法采用灭活癌细胞(S180,5×106/ml)0·2ml(或生理盐水)加入全血细胞(或白细胞)0·2ml和血浆0·3ml中,37℃温育1h,用流式细胞仪免疫荧光法测定红细胞CD35和白细胞(淋巴细胞、粒细胞)CXCR4分子表达量。分组:①癌细胞悬液0·2ml加全血细胞悬液0·2ml和血浆0·3ml;②生理盐水0·2ml加全血细胞悬液0·2ml和血浆0·3ml;③癌细胞悬液0·2ml加白细胞悬液0·2ml和血浆0·3ml;④生理盐水0·2ml加白细胞悬液0·2ml和血浆0·3ml。结果脐血红细胞CD35表达量在S180激活后下降不如正常人红细胞明显,而白细胞CXCR4表达量在S180激活后上升不明显;正常人全血红细胞CD35表达量在S180激活后明显下降(40·21%±11·52%vs28·65%±8·08%,P<0·01),而粒细胞CXCR4表达量明显上升(40·62%±17·89%vs64·18%±11·69%,P<0·01)。结论脐血红细胞免疫调控能力和白细胞免疫功能都明显低下。

兔Oddi氏括约肌细胞BK通道Alpha亚基在Pichia酵母中的高效表达、纯化和鉴定

目的用巴斯德毕赤酵母系统表达兔Oddi氏括约肌(SO)细胞BK通道α亚基,并进行纯化和鉴定。方法采用RTPCR扩增编码兔SO细胞BK通道α亚基B细胞表位区基因的cDNA,经测序正确将其克隆入酵母表达载体pPIC9K,以电穿孔法转化酵母GS115。经MD平板筛选重组子、G418筛选鉴定后,甲醇诱导表达,镍离子亲合层析法对表达上清进行纯化,进行SDSPAGE和免疫印迹分析。结果用RTPCR扩增出约1497bp的兔SO细胞BK通道α亚基基因的cDNA。序列分析显示,扩增序列与已发布的新西兰大白兔骨骼肌BK通道α亚基的cDNA序列完全一致。SDSPAGE显示本系统表达的α亚基融合蛋白Mr约为55000,表达量约为55mg/L,纯度为96%。Westernblot检测证明,该α亚基融合蛋白可与兔BK通道α亚基多克隆抗体特异性结合。结论克隆了编码兔SO细胞BK通道α亚基B细胞表位区基因的cDNA,并在毕赤酵母中成功地表达了该蛋白,为进一步研究BK通道提供了物质基础。

髓样抑制细胞免疫抑制机理的研究

目的:研究荷瘤小鼠来源的髓样抑制细胞(Myeloid derived suppressor cell,MDSC)在肿瘤免疫抑制中的作用机理。方法:用Percoll分离法从荷瘤小鼠的脾脏和骨髓中分离Gr-1+CD11b+MDSC;用流式细胞术检测MDSC对T细胞增殖的抑制作用;分别用生化法和ELISA技术检测MDSC体外培养上清中抑制性因子NO、ROS和IL-10、TGF-β的含量。结果:MDSC在荷瘤小鼠的脾脏和骨髓中聚集增多,且其在骨髓中所占的比例显著高于脾脏;MDSC可以明显抑制脾脏细胞的增殖,体外培养6小时的MDSC可以分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β。结论:本实验进一步证实MDSC可以通过分泌大量NO、ROS和IL-10、TGF-β抑制T细胞增殖。

R31L TNF-α突变体重组质粒的构建、真核表达及其产物的胞毒效应

目的:研究膜型、分泌型TNF-α的31位氨基酸在其生物学效应中的作用,进一步探讨TNF-α结构与生物学效应的关系。方法:采用重叠PCR方法将wt TNF-α31位精氨酸(R)密码子(CGC)定点突变替换成亮氨酸(L)密码子(CTC),构建R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,采用脂质体转染法将其瞬时转染COS-7细胞进行表达,通过MTT法检测R31LTNF-α突变体的胞毒效应。结果:酶切、PCR及测序鉴定证实目的基因R31LTNF-α正确连接到pcDNA3.0的多克隆位点;TNF-α31位突变可增强sTNF-α的胞毒效应,突变体的CC50值是野生型的1/10,而对mTNF-α的生物学效应无明显影响。结论:本实验成功地构建了R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,且在真核细胞COS-7中获得表达;TNF-α31位置换成亮氨酸后,主要增强其分泌型分子的胞毒效应,而对其膜分子无作用。

巨噬细胞对凋亡细胞的清除及炎症调控作用

胞葬作用(efferocytosis)是机体内凋亡细胞被吞噬细胞清除的生理过程,而巨噬细胞是一种重要的吞噬细胞。炎症是机体防御感染及修复损伤的保护性反应,但过度强烈的炎症和持续的慢性炎症则与许多疾病的发生和发展密切相关。巨噬细胞不仅可以通过对凋亡细胞的吞噬来避免炎症的发生,还可以通过在胞葬过程中与凋亡细胞及其代谢产物之间的相互作用获得主动性的抗炎效应。这一抗炎效应对炎症的及时消退及组织损伤后修复和再生过程的启动都至关重要。本文就近年来的研究进展对胞葬作用抗炎效应的产生机制进行综述。

Bim蛋白、端粒酶蛋白在骨恶性纤维组织细胞瘤中的表达及临床意义

目的探讨淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)相互作用的细胞凋亡调节因子(bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim)蛋白、端粒酶蛋白在骨恶性纤维组织细胞瘤中的表达及临床意义。方法采用免疫组化(EnVisionTM)法分别检测40例骨恶性纤维组织细胞瘤组织(观察组)及40例骨恶性纤维组织细胞瘤旁组织(对照组)中Bim、端粒酶蛋白的表达情况。结果 Bim蛋白、端粒酶蛋白在观察组、对照组阳性率的差异均有统计学意义(χ2=8.71,P<0.01;χ2=22.17,P<0.01)。Bim蛋白、端粒酶蛋白的表达均与骨恶性纤维组织细胞瘤直径、临床分期有关(P<0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤部位及组织学类型无关(P>0.05)。Bim蛋白与端粒酶蛋白在骨恶性纤维组织细胞瘤组织中的表达呈显著负相关(r=-0.56,P<0.01)。结论 Bim蛋白和端粒酶蛋白均参与了骨恶性纤维组织细胞瘤的形成,同时检测这2项指标有利于判断肿瘤恶性程度及预后。

Toll样受体7胞内区功能关键位点筛选及其机制研究(英文)

目的筛选出TLR7 TIR区对其信号传递起关键作用的位点,并解释该位点的作用机制。方法针对TLR7野生型序列,设计构建一系列TLR7缺失突变与点突变质粒。将这些质粒转染入HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告基因检测这些质粒对NF-κB信号通路的影响。利用免疫共沉淀与蛋白质印迹实验验证TLR7突变体与其下游接头蛋白MyD88结合能力的变化。结果通过对TLR7胞内区截短突变分析,发现在其TIR区存在一个由16个氨基酸残基组成的区域对其信号传递至关重要。进一步的研究发现,该区域存在一个RXR信号基序。该基序位于1004位与1006位的两个保守精氨酸残基,为TLR7正常信号传递所必需。通过免疫共沉淀与蛋白质印迹实验,可以发现TLR7位于1004位的精氨酸对其与下游蛋白MyD88的结合至关重要。结论成功鉴定出TLR7 TIR区1004位的精氨酸对其信号传递起重要作用,该位点是通过影响TLR7与MyD88结合的方式发挥功能。

人源重组ICOSIg对鼠不成熟树突状细胞的生物学作用

目的分析人源可诱导共刺激分子(ICOS)可溶性融合蛋白(ICOSIg)与鼠源不成熟树突状细胞(DCs)是否发生特异性结合及其一般生物学特性。方法通过流式细胞术结合特异性抗体检测了解ICOSIg与不成熟DCs的结合作用;以AnnexinⅤ/PI双染色、活细胞染料CSFE和CCK-8研究ICOSIg对DCs的细胞毒性作用;以[3 H]掺入法研究ICOSIg对于混合淋巴细胞反应的阻断作用。结果 ICOSIg可结合小鼠DCs表面的ICOSL,ICOSIg不引起DCs早期和晚期凋亡,不影响DCs细胞的增殖,可以抑制不同基因小鼠脾细胞的混合淋巴细胞反应。结论本实验室构建的体外表达的ICOSIg具有较强的生物学活性,对鼠DCs无明显的生物学毒性作用,首次从实验角度证实人源ICOSIg可以特异性结合小鼠不成熟DCs表面配体ICOSL,可以用于进一步探讨ICOSL/ICOS共刺激通路的免疫作用。

非小细胞肺癌组织MAGE-1蛋白的Western印迹分析

目的检测黑素瘤抗原-1(MAGE-1)蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,探讨以该蛋白作为疫苗对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。方法采用Western印迹法对3种人肺癌细胞系和56例NSCLC标本及相邻正常肺组织标本MAGE-1蛋白的表达情况进行研究。结果3种人肺癌细胞系均表达MAGE-1蛋白;56例NSCLC标本中,25例表达MAGE-1蛋白,而相邻正常肺组织均不表达。结论MAGE-1蛋白在NSCLC中呈高频率表达,提示该蛋白有望成为对NSCLC患者进行免疫治疗的适宜靶点。

MAGE-3蛋白在非小细胞肺癌中的表达

目的检测MAGE-3蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,为该蛋白作为疫苗来源对NSCLC患者进行免疫治疗提供依据。方法采用流式细胞术(FCM)对MAGE-3蛋白在3种人肺癌细胞系和56例NSCLC标本及相邻正常肺组织标本中的表达情况进行比较。结果3种人肺癌细胞系均表达MAGE-3蛋白;56例NSCLC标本中,26例表达MAGE-3蛋白,其中鳞状细胞癌的表达率明显高于腺癌的表达率(P<0.01),而相邻正常肺组织均不表达该蛋白。结论MAGE-3蛋白在NSCLC中呈高频率表达,提示该蛋白是对NSCLC患者进行免疫治疗的适宜疫苗来源。

MAGE基因在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的检测MAGE基因家族的三个成员MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达情况,探讨以该基因家族成员作为靶点对NSCLC患者进行免疫治疗的可能性。方法采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和DNA印迹(Southern blot)的方法,对MAGE基因家族的三个成员MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA在56例NSCLC中的表达情况进行研究。结果 56例NSCLC肿瘤组织中,33例表达MAGE基因,正常肺组织均不表达;MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3 mRNA的表达例数分别为27、18、30。结论 MAGE基因家族成员在NSCLC患者中呈高频率表达,提示该基因是对NSCLC患者进行免疫治疗的适宜靶点。

Tim-3中和抗体对哮喘小鼠T淋巴细胞功能的影响

目的探讨Tim-3中和抗体对支气管哮喘（简称哮喘）小鼠外周血及支气管肺泡灌洗液（BALF）中T淋巴细胞体：外增殖功能和细胞因子合成功能的影响。方法分别采集实验组和对照组外周血和BALF，并分离出T淋巴细胞进行体外分组培养，各组分别以不同浓度的Tim-3中和抗体进行干预，并在不同的时间进行检测。用MTT法分别测定各组细胞的增殖情况，用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定T淋巴细胞白细胞介素4（IL-4）、干扰素γ（IFN-γ）的水平。结果与对照组比较，Tim-3中和抗体对体外培养的实验组小鼠外周血和BALFT淋巴细胞的增殖均有抑制作用，其作用强度（在-定范围内）随剂量的增加和时间的延长而加强（均P〈0．05）；而且对实验组小鼠的抑制作用明显强于对照组小鼠（P〈0．05）；同时实验组小鼠外周血和BALFT淋巴细胞经抗体干预后，IL-4的表达水平较正常组明显下降，IFN-γ明显增加（P〈0．05）。结论 Tim-3中和抗体能抑制实验组小鼠T淋巴细胞的增殖和IL-4的合成，增加IFN-γ的分泌。Tim-3可能作为哮喘治疗新的分子靶点。

IgE高亲和力受体与哮喘的研究进展

儿童哮喘是Ⅰ型变态反应性疾病,IgE在其发病过程中具有极其重要的作用.IgE与其高亲和力受体（FcεR Ⅰ）结合,可以引起肥大细胞的脱颗粒、白三烯的合成和细胞因子的分泌,进而引起气道慢性炎症和气道平滑肌痉挛.目前的研究认为Src激酶家族对FeeR Ⅰ信号传导途径有重要作用.该文综述了关于FcεR Ⅰ的表达调节、信号传导、FcεR Ⅰ与哮喘发病之间的关系及如何应用FcεR εⅠ进行哮喘诊断和治疗.

sFcεRI的特点及临床研究介绍

过敏是常见的l临床表现．虽不危及患者生命．但因伴有瘙痒，故而使其日常生活、工作受到影响．导致生活质量下降。过敏的发病机制可能与机体产生针对IgE高亲和力受体（FcεRI）或IgE的自身抗体、免疫分子、补体等诸多因素有关。近年来，对于抗FcsRI和IgE自身抗体陆续有报道，根据其生物学活性及其与疾病的相关临床表现推测．这类抗体可能参与了具有过敏反应表现的自身免疫性疾病的发生和发展。但关于FcεRI的一个新形式——血清可溶性I姐高亲和力受体（sFcsRI）．其与过敏疾病间的关系尚不明确。本文就目前研究较少的sFcsRI进行简单介绍。

背书包对儿童生理学和生物力学的影响

学龄儿童背书包往返学校是一项基本的日常生活行为,书包已被作为一种＂职业负荷＂[1-2],因对学龄儿童的身体健康产生严重影响而受到广泛的关注。目前,国内外关于儿童书包重量的调查发现,绝大多数儿童的书包重量超过自身体重（bodyweight,BW）的10%[3-5],有的超过美国运动生理学家推荐的15%BW负荷标准。