基于人脂肪组织获取基因构建pET28a-leptin(瘦素)重组子

背景:新近的一些研究认为,采用体外重组瘦素替代疗法对遗传性肥胖、难愈性创面和内源性瘦素缺乏应是行之有效的方法。目的:取人脂肪组织获取瘦素基因,构建pET28a-leptin重组子。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2004-06/2007-12在江西省医学科学研究所抗肿瘤室完成。材料:取自22岁汉族女性行重睑手术时皮下脂肪组织,冻存于液氮中备用,供者知情同意。方法:取人脂肪组织,反转录-聚合酶链反应得到瘦素基因后,通过DNA重组技术克隆至pMD18T载体与pET28a原核表达载体,EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切及测序鉴定。主要观察指标:①cDNA扩增结果。②重组质粒鉴定。③DNA测序结果。结果:扩增得到520bp目的基因;所构建重组瘦素原核表达载体pET28a-leptin经双酶切电泳见520bp目的条带,DNA测序与相应基因序列同源性达100%。结论:通过DNA重组至pET28a原核表达载体,经EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切及测序鉴定成功构建pET28a-leptin重组子。

GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建及其对生长因子促细胞增殖效应的影响

目的:通过构建GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,研究磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3,GPC3)对成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2,FGF2)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-2,IGF2)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein-4,BMP4)促细胞增殖效应的影响。方法:应用基因重组技术及限制性内切酶酶切构建并鉴定pEGFP-N2-GPC3增强型绿色荧光蛋白真核表达载体,经脂质体LipofectamineTM2000介导转染SK-Hep-1后,通过G418(600μg/ml)筛选出抗性克隆,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测GPC3mRNA在真核细胞中的表达,Western印迹法检测GPC3蛋白在真核细胞中的表达,并在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况,采用MTT法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2、TGF-β1、BMP4促细胞增殖效应的影响。结果:限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的真核细胞胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR及Western印迹法表明GPC3在真核细胞中成功表达,GPC3抑制了FGF2对SK-Hep-1细胞的增殖效应,而不抑制IGF2、TGF-β1、BMP4的促增殖作用。结论:编码的氨基酸序列与人GPC3完全一致;构建完成真核表达重组质粒pEGFP-N2-GPC3;GPC3基因在SK-Hep-1中成功表达;GPC3在FGF2信号通路中可能发挥负性调控因子的作用。