重要呼吸道病毒病原的多重RT-PCR检测

目的建立一种可同时快速检测引起人呼吸道感染的重要病毒病原的检测方法。方法通过对PCR反应条件的优化,建立同时检测甲型流感病毒(IA)、呼吸道合胞病毒(RSV)和SARS冠状病毒(SARS-CoV)的多重RT-PCR方法。结果该法可同时或分别扩增IA258bp、RSV348bp和SARS-CoV438bp的基因片段。检测的敏感性分别为101.7TCID50/ml、10TCID50/ml和101·5TCID50/ml。采用相同的反应体系和条件,分别对其他7种呼吸道病毒(包括乙型流感病毒,副流感病毒2型,柯萨奇病毒B3和B5血清型及腺病毒2、3和7血清型)进行扩增,均未检测出扩增产物。结论此种多重RT-PCR法可在6h内完成,适用于三种重要呼吸道病毒的快速甄别。

兔出血症抗体间接ELISA检测试剂盒的研制与初步应用

目的建立检测兔病毒性出血症（RHD）血清抗体的间接ELISA方法并组装成试剂盒，进行初步应用。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯RHDV病毒粒子作为包被抗原，优化反应条件和筛选试剂，建立间接ELISA检测方法，组装试剂盒并对其总体性能进行评价。结果试剂盒敏感性为血凝抑制试验的4～32倍，重复性和特异性良好，保质期为4℃ 3个月。对105份兔血清进行随机检测，与血凝抑制试验的复核率为95％。结论本试剂盒可以在检测和科研中初步应用。

血清乙型肝炎病毒RNA定量分析系统的建立

目的 :建立针对血清乙型肝炎病毒 (hepatitisBvirus,HBV)转录体的定量分析系统 .方法 :从血清中提取病毒DNA和RNA ,采用竞争性PCR技术、Southern blotting及分子克隆等技术 ,建立循环病毒DNA和RNA(转录体 )的定量分析系统 ,并应用其对抗病毒药物Lamivudine干预治疗后HBV感染患者血清中HBVDNA和RNA结构和数量的变化进行分析 .结果 :建立了两个针对X区RNA的定量分析系统 ,可检测带有全长型和顿挫型 3′端结构的转录体 .我们还建立了HBVX ,Core和X PreCore区段的DNA/RNA定量分析系统 ,三者分别与HBV基因复制的早、中、晚期对应 .此研究初步阐明了Lamivudine治疗期间患者血清中HBVDNA和转录体结构和数量的变化 .治疗 8wk以后 ,在Core和X PreCore区DNA拷贝数从 10 9·mL-1下降为 10 5·mL-1,下降幅度明显高于X区(下降至 10 7·mL-1) ,其比率更准确地反映了Lamivudine的作用效率 ,可用于疗效的评估 .转录体的拷贝数仅有小幅下降 ,采用锚定的Oligo(dT)引物检测的两种全长和顿挫型Ploy(A)RNA (10 5·mL-1)明显低于X区 (10 7·mL-1)RNA的拷贝数 ,提示在基因复制过程中前基因组RNA的Ploy(A)尾被去除 .结论 :这一分析系统可显示血清中HBV转录体含量及定量不同 3′端结构 。

不同人群乳头瘤病毒DNA分型的检测及其临床意义

目的:分析尖锐湿疣(CA)患者及无症状的高危自检者、正常体检者人乳头瘤病毒(HPV)的DNA分型检测结果及其临床意义。方法:选择门诊就诊的CA患者527例(CA组)、高危性行为自检者208例(HR组)和正常体检者197名(PE组),应用凯普导流杂交技术对3组人群样本进行HPV DNA分型检测,分析各组HPV检出阳性率、HPV优势型别分布和HPV亚型多重感染情况。结果:CA组患者HPV检出阳性率为98.29%,HPV感染的优势型别为6、11、33和52型;HR组患者HPV检出阳性率为26.44%,HPV感染的优势型别为6、11、33和66型;PE组人群HPV检出阳性率为5.58%,HPV感染的优势型别为6和11型。HR和PE组HPV检出阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05);CA组患者HPV多重型别混合感染检出阳性率为36.43%,HR组多重型别混合感染检出阳性率为5.77%,二者比较差异有统计学意义(P<0.01);CA组患者多重型别混合感染以二重感染阳性率最高,为18.41%;三重混合感染率次之,为11.20%;最多重感染为七重型别混合感染,阳性率为0.38%。结论:3组人群的HPV感染均以低危型6和11型最多见;高危自检者与正常体检者两者在临床上均无症状,但前者HPV检出阳性率明显高于后者;CA组患者HPV混合型别感染阳性率明显高于HR组,且多以二重或三重型别混合感染形式多见。

慢性乙肝患者血清HBV cccDNA检测的临床意义

目的探讨慢性乙肝患者血清HBV cccDNA与现有血清学指标(AST、ALT、TBIL、HBeAg、HBV DNA)的相关性。方法选取解放军第309医院2009年5月-2012年5月就诊的慢性乙肝患者58例,采用Roche C6000电化学发光法检测HBeAg;日立Hi7600全自动生化分析仪检测ALT、AST、TBIL;采用实时荧光定量PCR检测血清HBV DNA、HBVcccDNA载量。结果血清HBV cccDNA与HBV DNA有很好的相关性(r=0.880,P=0.000)。HBeAg阳性组HBV cccDNA阳性的比例为67.6%,显著高于HBeAg阴性组的37.5%(χ2=5.170,P=0.023)。血清HBV cccDNA与肝组织炎症的严重程度呈正相关(χ2=4.819,P=0.028)。结论血清HBV cccDNA定量检测是评价HBV复制情况和肝细胞损伤程度较为可靠的指标。

猪2型圆环病毒原核表达产物的免疫原性测定

目的检测猪2型圆环病毒(PCV2)全基因组原核表达产物的免疫原性。方法根据PCV2JXL株序列(GenBank登录号AY491310),设计合成引物,利用多聚酶链式反应(PCR)从含有PCV2接种猪肾细胞PK15中扩增了Cap蛋白的氨基端片段(737-421nt),克隆入上游带有谷光苷肽-S-转移酶的原核表达载体pGEX-6p-1中,获得重组质粒pGEX-PCV737-421。PCV2Cap蛋白羧基端(426-37nt)和Rep蛋白已在过去的研究中分别融合表达。利用IPTG对3种重组大肠杆菌BL21进行诱导,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)以及对PCV2阳性猪多抗血清的蛋白免疫印迹试验,在此基础上,将3种SDS-PAGE分离粗纯的重组表达产物碾碎后分别免疫BALB/c小鼠,用获得的抗鼠血清与PCV2病毒感染PK15细胞做间接免疫荧光抗体试验(IFA)。结果PCV2Cap蛋白的氨基端片段能在大肠杆菌中表达,且Cap蛋白羧基端和Rep蛋白的原核表达产物都能在免疫印迹试验中被PCV2阳性猪血清检测出特异性条带,重组蛋白免疫鼠血清可在IFA试验中观察到特异性的荧光分布,即检测到培养细胞中的病毒抗原。结论PCV2全基因组都可以用原核系统高效表达,且表达产物具有免疫原性。

HPV L1 C-末端保守序列多肽抗血清对临床标本中不同型别HPV的检测

目的测试自行制备的HPV L1C-末端保守序列多肽抗血清对外阴及宫颈病变标本中人乳头瘤病毒(HPV)的检出能力。方法收集女性外阴及宫颈病变标本,以MY09/11为通用引物行HPV通用PCR检测,在此基础上以GP5+/6+为内引物行HPV的巢式PCR检测。PCR扩增产物用微孔板杂交法确定HPV型别。标本同时用多肽抗血清行ELISA检测,并对不同型别HPV阳性的标本行Western bolt检测。结果临床标本的HPV检出率,通用引物PCR为70.3%(64/91),巢式PCR为86.8%(79/91),ELISA检测为84.6%(77/91),ELISA法的检出率与巢式PCR相当,高于通用引物PCR。对7个不同型别HPV阳性标本的Western bolt检测,多肽抗血清显示了良好的多价反应性。结论该HPV L1C-末端保守序列多肽抗血清对外阴及宫颈病变标本中的HPV具有良好的检出能力,对多型HPV具有良好的多价反应能力。

高亲和力抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体制备及检测变异HBsAg方法的建立

目的制备抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)单克隆抗体,建立检测变异HBsAg的方法。方法用血源HB-sAg免疫BALB/c小鼠,制备可以识别变异HBsAg的抗-HBs单抗。筛选出可以较好识别变异HBsAg的单抗mAb1,优化该抗体ELISA检测HBsAg的方法,与2种HBsAg检测试剂比较检测变异HBsAg的能力。对6份临床样品进行检测及序列分析,以证实方法的可靠性。结果经过筛选,得到1种可以较好识别包括G145R在内的大多数变异HB-sAg的单抗。检测变异HBsAg的能力优于市售HBsAg诊断试剂。结论制备的单抗可以用于ELISA检测变异HB-sAg,减少HBsAg变异株的漏检率。

南昌地区冬春季呼吸道感染儿童流感病毒的检测分析

目的了解南昌地区冬春季呼吸道感染儿童甲型流行性感冒(流感)病毒、乙型流感病毒的检出率、构成等流行病学特征。方法对6 130例于2010年10月至2011年3月来江西省妇幼保健院就诊的被诊断为呼吸道感染的儿童,用间接免疫荧光法检测流感病毒IgM抗体。结果甲型流感病毒检出率为0.75%,乙型流感病毒检出率为10.39%,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。乙型流感病毒检出率在2010年10-12月较低,在2011年1月呈爆发态势,检出率上升5倍。结论引起南昌地区2010-2011年冬春季呼吸道感染患儿的主要流感病毒为乙型流感病毒,且其在2011年1月有爆发流行的趋势。

酶联免疫吸附法检测HIV_((1+2))抗体时的影响因素

1资料和方法 1.1资料 我院2011年1月-2012年1月3 665例住院及门诊患者的血清样本,其中孕产妇1 085例、手术患者2 350例、性病门诊130例、其他患者100例。尽量做到清晨空腹抽取静脉血3～5 ml,分离血清24 h内检测。1.2仪器与试剂芬兰LaborMK3酶标仪,芬兰LaborMK2洗板机,

西尼罗病毒一步实时RT-PCR检测准确度评价

目的了解已建立的一步实时RT-PCR对西尼罗病毒感染细胞和组织的灵敏度及其对国内常见的黄病毒属病毒的特异性,为西尼罗病毒感染的实验室检测和流行病学调查奠定基础。方法使用VectorNTISuite8软件比较探针与西尼罗病毒不同系毒株之间的同源性。采用西尼罗病毒感染的Vero细胞培养上清和BALB/c小鼠脑组织样本评价一步实时RT-PCR法的灵敏度,同时用国内常见的黄病毒属病毒评价其特异性。结果此一步实时RT-PCR法可用于西尼罗病毒1系多数毒株的检测,灵敏度高,对西尼罗病毒的最低检出浓度为5.75×10-2pfu/ml;与黄病毒属乙型脑炎、登革热、蜱传脑炎以及甲病毒属东部马脑炎等虫媒病毒均未出现交叉反应。结论西尼罗病毒一步实时RT-PCR法具有灵敏度高、特异性强的特点,适用于西尼罗病毒感染细胞和组织的早期检测及流行病学调查。

血液透析患者乙肝合并丙肝病毒标志物检测分析

目的:调查血液透析患者乙肝重叠感染丙肝的情况,探讨乙肝和丙肝感染之间的相互关系。方法:对436例血液透析患者乙肝阳性血清进行了HCV标志物的检测。结果:发现436例乙肝感染的病例中有25例患者受到过丙肝病毒感染,感染率为5.7%,说明乙肝与丙肝重叠感染在血液透析乙肝患者中分布面较广,这与透析时间、输血有关。结论:乙肝病毒对丙肝病毒复制有抑制作用,临床对血液透析乙肝患者的治疗过程中,考虑对丙肝病毒感染的控制是有必要的。