弓形虫基因组文库的建立、特异克隆的筛选和弓形虫病的DNA诊断

首次建立弓形虫人株(ZS_2株)基因组文库,筛选出一个弓形虫特异DNA片段的克隆。对该克隆的DNA片段(1.1kb)进行了限制性内切酶图谱分析。应用Southern印迹法及斑点印迹法检测,结果示同位素^(32)P标记的该克隆DNA片段能与弓形虫DNA、人工感染弓形虫幼猪白细胞和胸腺DNA、弓形虫感染病人DNA杂交,但不与正常人、正常幼猪外周血白细胞、正常小鼠脾脏、恶性疟原虫、肺孢子虫、pBR322的DNA杂交。斑点杂交检测低限为100个弓形虫或500pg弓形虫DNA。该探针已成功地应用于多种弓形虫感染病例的检测,为弓形虫病提供了一个特异、灵敏的DNA诊断方法。

用多聚酶链反应诊断弓形虫病

根据本实验室筛选出的弓形虫(ZS_2株)特异DNA克隆片段的部分顺序分析的数据,设计并合成特异的寡核苷酸引物对,建立多聚酶链反应诊断弓形虫病的方法。不同来源的弓形虫株和7例畸形胎儿DNA经体外基因扩增,扩增产物经电泳检测,均出现特异的扩增条带。对42例肝炎综合症的婴儿和33例不良生育史的孕妇的外周血白细胞DNA检测,分别为6例和4例阳性。50例正常人外周血白细胞DNA检测均为阴性。对扩增产物进行Southern印迹分析,以^(32)P标记克隆的弓形虫特异DNA片段为探针,能与阳性病例特异的扩增条带杂交,而不与阴性样品的扩增产物杂交。本法并与其它检测方法的结果相比较,具高度特异、敏感且快速的优点。

SPA-ELISA检测抗弓形虫抗体的实验研究

我们用弓形虫NT株虫体抗原包被聚苯乙烯酶标板,建立了葡萄球菌A蛋白-酶联免疫吸附试验(SPA-ELISA)检测抗弓形虫抗体的方法.经与弓形虫可溶性抗原包被结果对照,P>0.05两法无显著性差异.在方法学比较研究中,与间接血凝试验及免疫酶染色试验检测符合率分别为76.6%及92.5%.SPA-ELISA法检出率显著高于间接血凝法.SPA-ELISA为目前公认的一种较好的检测方法.敏感性高,假阴性率低,可以对人和动物血清进行检测.

SPA-ELISA检测弓形虫感染鼠尿中的循环抗原

[目的 ]探索弓形虫感染早期诊断的简便方法。 [方法 ]用SPA ELISA检测轻度、中度和重度感染弓形虫鼠尿中弓形虫循环抗原 (TCA)。 [结果 ]轻度、中度和重度感染弓形虫 3组鼠尿中均检出TCA ,上述 3组分别于弓形虫感染后d6 、d3和d4显示阳性斑点。 [结论 ]SPA ELISA能检出弓形虫感染鼠尿中的弓形虫循环抗原 ,可用于弓形虫感染的早期诊断。

核酸原位杂交检测人淋巴结组织中的弓形虫

目的：探讨弓形虫感染的淋巴结组织中的病原体检测。方法：用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和基因工程技术制备弓形虫（ＲＨ株）特异ＤＮＡ克隆片段，以地高辛随机引物法标记克隆的弓形虫ＤＮＡ片段作为探针，与淋巴结组织切片中核酸原位杂交试验（ＩＳＨ）检测病理标本中的弓形虫ＤＮＡ。结果：３２例何杰金淋巴瘤（ＨＤ）和４１例非何杰金淋巴瘤（ＮＨＬ）病理标本中各有一例阳性，４７例慢性淋巴结炎（ＣＬ）病理标本中呈ＩＳＨ阳性者２例，总阳性率为３．３％（４／１２０）。研究证明，所制备的探针能检测１０ｐｇ的ＤＮＡ，且特异性强。结论：核酸原位杂交为弓形虫病的病理标本中病原体检测提供了可行的方法。

弓形虫感染的循环抗原检测的研究

本文首次报道应用竞争抑制酶联免疫吸附试验(I-ELISA)观察到人工感染弓形虫兔血清循环抗原的消长规律。在感染后1d即可测出循环抗原(CA),4d后CA水平升高,10—13d达高峰,然后迅速下降,感染60d后测不到。提示CA的检测对弓形虫的活动性感染具有较好的诊断价值。结果还表明I-ELISA是一种敏感、特异性高、简便而快速的检测CA的方法。

特异弓形虫DNA顺序的克隆及用于弓形体病的检测

弓形体病是一种人畜共染性疾病,它对免疫抑制的患者常易致命。孕妇一旦被弓形虫感染,可通过母婴垂直传播,造成胎儿畸形或死胎。

弓形虫RH株在实验感染小鼠体内分布的研究

目的 以间接免疫酶法观察弓形虫 (RH株 )感染时的急性期病变特点及虫体在主要脏器的动态分布 ,以期为弓形虫病的病理诊断提供依据 ,并对弓形虫致病机理加深理解。方法 用弓形虫 RH株速殖子 10 3个经腹腔感染昆明小鼠 ,于感染后第 2、4、6和 8d,取肝、脾、肺和脑进行间接免疫酶染色。结果 虫体首先在肝脏内被发现 (第 2 d) ,其次是脾和肺 (第 4d) ,最后是脑 (第 8d)。感染早期 ,肝与脾边缘均可见虫体且较多 ;随时间延长 ,肝、脾与肺组织内部逐渐发现少量虫体 ,分布均匀 ;随病程延长 ,各脏器内虫体由少增多 ;脑内发现虫体最晚 ;小鼠体内虫体大量增殖 ,病变严重 ,最终死亡。结论 间接免疫酶染色方法可清楚显示弓形虫感染急性期的组织内弓形虫速殖子及抗原成份。小鼠多脏器被累及如肝、脾、肺和脑。间接免疫酶染色观察结果提示 ,经腹腔感染小鼠时 ,虫体播散途径为 :虫体首先直接侵入腹腔内的器官 ,再通过血液循环播散 。

急性弓形虫病小鼠超氧化物歧化酶活性测定与同工酶分析

目的了解急性弓形虫病对宿主体内是否发生氧化损伤。方法用小鼠建立急性弓形虫病模型，采用羟胺法测定小鼠血浆及心、肝、肺组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用薄层聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦技术对SOD同工酶进行分析。结果小鼠于感染弓形虫后第3天其SOD活性呈反应性升高，于第6天显著下降；正常小鼠血浆及。心、肝、肺组织的SOD同工酶带分别为6、2、4与3条，感染弓形虫6d后的小鼠肝脏少一条酶带（PI＝8．1）。结论氧自由基参与了急性弓形虫病的病理生理过程。

免疫酶染色试验诊断弓形虫感染的研究

以弓形虫的玻片为抗原,进行了免疫酶染色试验(IEST),检测11份阳性兔血清和34份弓形虫病人血清,阳性率分别是100％和94.1％。4份阴性兔血清和108份阴性人血清,其假阳性率为0％和1.85％。此法与血吸虫病、肺吸虫病、疟疾等均无交叉反应,表明对弓形虫有较高的特异性。15份已知血清每隔半月进行了4次重复试验,其符合率及GRMT均无显著性差异。此法还对健康体检者、不良生育史孕妇和智力低下的儿童进行了检测,其结果分别为8.46％、16.33％和28.26％。此检出结果与IFA无差异。本法具简单、经济、敏感、特异、重复性好等优点,可在现场推广应用。

地高辛素标记弓形虫DNA探针的制备及在产前诊断的应用

本文建立了地高辛素标记的弓形虫ＤＮＡ探针并在２３例产前咨询孕妇中作产前诊断。通过聚合酶链反应扩增弓形虫ＲＨ株ＴＧＲ４核酸片段，扩增产物７７８ｂｐ片段经寡核苷酸层析柱纯化后，用地高辛素标记作为探针，与待检材料斑点杂交。结果显示该探针与待杂交的弓形虫ＲＨ、ＺＳ１、ＺＳ２、ＳＨ１株ＤＮＡ杂交；而与恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、杜氏利什曼原虫、大肠杆菌、巨细胞病毒ＤＮＡ无杂交。并能在待杂交液中检测出相当于１ｐｇ水平ＤＮＡ，表明该探针具有高度的特异性及敏感性。检测２３例孕期１０—１４周孕妇中，阳性３例，其中一孕妇外周血、绒毛组织及羊水均呈阳性。另一例的外周血及绒毛组织呈阳性。该探针稳定、敏感、操作简单，具有推广意义。

酶联免疫吸附试验和间接血凝试验检测猪弓形虫病的比较

酶联免疫吸附试验和间接血凝试验检测猪弓形虫病的比较Ｃｏｍｐａｒｓｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓａｙｗｉｔｈｉｎｄｉｒｅｃｔｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｅｓｔｉｎｄｉａｇｎｏｓｅｓｏｆｓｗｉｎｅｔｏｘｏｐｌａｓ...

孕妇弓形体IgM抗体检测及其临床意义

材料与方法 收集早孕妇女血标本416份,分离血清,同荷兰阿克苏公司弓形体IgM试剂盒(酶联免疫吸附试验)包括阳性对照,阴性对照标准血清,进行弓形体IgM测定,按试剂盒上说明进行操作及有效标准进行判断、对检出IgM阳性的孕妇均用上海第二医科大学弓形体PCR试剂盒再次进行DNA检测,所有阳性孕妇均在孕21～24周抽取胎儿脐静脉血查胎儿弓形体IgM,所有孕妇均观察至妊娠结束,对阳性孕妇均给予螺旋霉素及磺胺嘧啶治疗。

应用ABC-Dot-ELISA检测弓形虫抗体的研究

应用弓形虫可溶性抗原行ABC—Dot—ELISA,对10份病人血清28份感染兔血清和10份阴性人血清及38份阴性兔血清进行检测,与常规Dot—ELISA相比,两者的符合率一致,但其敏惑度可提高5.0倍。与卫氏并殖吸虫、华枝睾吸虫和日本血吸虫病人和感染动物,进行了交叉反应,除与急性血吸虫病人出现阳性反应(14/16)外,其余未见交叉反应。阳性血清经吸收抑制后,抗体滴度下降明显。本法特异性高、敏感性强、重复性好,抗原可长期保存;结果判断方便,阳性反应斑点经久不退,可待复查。

循环抗原阳性对弓形虫病诊断价值的研究

应用双抗体ＥＬＩＳＡ检测弓形虫循环抗原（ＣＡｇ）阳性者的血液及组织液样本４１例，进行病原学对照检查，结果２９例检获弓形虫，两者的符合率达７０．７％。不同样本中的虫体检出率依次为羊水３／３，乳汁１／１，胚胎组织１／１，脑脊液２１／３０，血清３／６。另外，对２９例疑似中枢神经系统弓形虫病患者，取脑脊液进行不同免疫学指标检测。结果，ＣＡｇ于发病３ｄ即可测出，总阳性数为２６例；ＩＨＡ抗体于发病５ｄ出现阳性，阳性数为４例；ＥＬＩｓＡ一ＩｇＭ及ＩｇＧ抗体在发病７ｄ后逐渐出现阳性，阳性数分别为５例和１例。研究结果证实，ＣＡｇ作为弓形虫早期、急性感染的一个指标，具有重要的诊断学意义。

聚合酶链反应掺入法制备标记探针检测弓形虫感染的研究

本文采用聚合酶链反应（PCR）技术，以Dig一i1—dUTP代替部分dTTP直接制备标记弓形虫特异性rDNA基因片段作为探针，用于检测弓形虫感染。该探针和弓形虫核酸抽提物杂交阳性，而与恶性疟原虫、间日疟原虫、杜氏利什曼原虫以及正常人血样核酸抽提物杂交阴性，该探针至少可检测出相当于156虫数的水平，结果表明：PCR掺入法是一种简便、有效的制备标记探针的方法，以该法制备的弓形虫rDNA基因探针适用于弓形虫感染的诊断及流行病学调查研究。

三种凝集试验检测弓形虫抗体的定性和定量比较

[目的 ]评价用于检测弓形虫抗体的我室改良凝集试验 (MAT 1)、日本的胶乳凝集试验 (LAT)和法国的改良凝集试验 (MAT 2 )的实用价值。 [方法 ]用 3种试验对 2 88份人血清进行检测 ,比较阳性检出率与符合率等 ,并对检测的半定量结果进行统计分析。 [结果 ]3种试验的阳性率 (9 7%、 8 9%和 8 1% )无显著性差异 (χ2 =0 392 ,P >0 0 5 )。平行检测相同对象的结果显示 :MAT 1与LAT的总符合率为 93 7% ,两法的相关系数r =0 6 13;LAT与MAT 2的总符合率为 94 5 % ,两法的相关系数r =0 5 5 1;MAT 2与MAT 1的总符合率为97 3% ,两法的相关系数r =0 841。应用配对资料的卡方检验进行差异的显著性检验 ,结果均无显著性意义(P >0 0 5 )。而且 ,3种凝集试验中任两法间的正相关均具有非常显著性意义 (P <0 0 0 1)。 [结论 ]检测弓形虫抗体的MAT 1、LAT和MAT 2具有很好的符合性 ,提示 3种方法用于常规普筛和血清流行病学研究时可以相互替代。

免疫酶染色试验诊断弓形虫感染的初步研究

以弓形虫的玻片为抗原，进行了免疫酶染色试验（ＩＥＳＴ），检测２０份阳性兔血清和５２份阳性人血清，阳性率分别为１００％和９６．１５％；２０份阴性兔血清和１９３份阴性人血清，假阳性率为０和１．０４％；此法与血吸虫病、肝吸虫病及疟疾均无交叉反应，说明对弓形虫有较高的特异性；用该法对精神病患者、孕妇及健康人群进行了弓形虫感染的检测，其结果分别为２４．５１％、１３．３５％和７．３２％，此结果与染色试验（ＤＴ）无显著性差异。ＩＥＳＴ法具有简便、经济、敏感、特异等优点，适用于现场推广应用。