HHT联合低剂量Ara-c与RNA诱导K562细胞凋亡的研究

目的:探讨高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)联合小剂量阿糖胞苷(arabinsylcytosine,Ara-c)与RNA协同作用对K562细胞凋亡的影响。方法:应用四唑盐(MTT)比色法分析细胞增殖率,倒置显微镜下观察细胞形态学变化、测定细胞蛋白质的含量及碱性磷酸酶(AKP)活性,观察提取的扬子鳄RNA与高三尖杉酯碱联合小剂量阿糖胞苷对K562细胞凋亡的影响。结果:①高三尖杉酯碱联合小剂量阿糖胞苷可协同诱导K562细胞凋亡。②RNA能增强高三尖杉酯碱联合小剂量阿糖胞苷对K562细胞增殖的抑制作用。结论:高三尖杉酯碱联合小剂量阿糖胞苷能有效诱导白血病细胞系K562细胞凋亡,RNA能增强高三尖杉酯碱联合小剂量阿糖胞苷的作用。

GPR30-PI3K/Akt信号通路在三阴性乳腺癌转移中作用的体外研究

目的探讨GPR30-PI3K/Akt信号通路在三阴性乳腺癌转移中的作用机制。方法采用Western blotting检测4种乳腺癌细胞系中GPR30蛋白的表达情况和不同药物作用后MDA-MB-468细胞中p-PI3K蛋白的表达变化;应用免疫荧光法检测GPR30在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468中的定位;通过划痕实验检测GPR30-PI3K/Akt信号通路对细胞迁移能力的影响。结果①三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468可高表达GPR30,后续确定选用MDA-MB-468细胞作为研究对象。②在MDA-MB-468细胞中,GPR30主要定位于胞质和胞膜上。③p-PI3K蛋白的表达水平随着GPR30激动剂(E_2和G1)浓度及作用时间的增加而增高,具有浓度及时间依赖性(P<0.05);而使用GPR30特异性阻断剂(G15)处理细胞后,p-PI3K蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。④经E_2及G1处理后,MDA-MB-468细胞迁移能力显著增强(P<0.05),而G15及PI3K抑制剂(LY294002)处理后其迁移能力明显减弱(P<0.05)。结论在三阴性乳腺癌中,GPR30与PI3K/Akt信号通路之间可能存在某种交叉关系并参与三阴性乳腺癌的转移进程。

胃癌及胃腺癌细胞系中PPAR-γ的表达及其临床意义

目的观察过氧化酶体激活物增殖受体y（PPAR-y）在胃癌组织及胃腺癌细胞系（SGC7901）中的表达，并探讨其临床意义。方法采用免疫组化SP法，检测50例胃癌、癌旁组织以及SGC7901中PPAR-y的表达。结果PPAR-y蛋白在胃癌中的表达为58％，明显高于癌旁组织的表达（28％）（P〈0．01）。PPAR-y蛋白在SGC7901细胞系中呈阳性表达。PPAR-y蛋白在低分化癌组织、侵及浆膜层、有淋巴结转移（P〈0．01）和分期晚（P〈0．05）的胃癌组织中表达增高，与性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤部位无关（P〉0．05）。结论PPAR-y蛋白在胃癌组织表达上调，提示PPAR-y蛋白不仅与胃癌的发生有关，而且与其进展有关，有可能作为检测胃癌的分子标志物并可提示其预后。

人端粒酶逆转录亚单位(hTERT)基因特异性siRNA对MCF-7细胞生长抑制作用的研究

目的研究人端粒酶逆转录亚单位(hTERT)特异性siRNA对MCF-7细胞体外生长及体内肿瘤形成能力的抑制作用。方法设计并化学合成针对hTERT的siRNA,用脂质体转染法将其导入MCF-7细胞内,通过软琼脂克隆形成试验及接种裸鼠的肿瘤形成实验,观察hTERT-siRNA对人乳腺癌MCF-7细胞体外及体内的生长抑制作用。结果软琼脂克隆形成试验显示,hTERT-siRNA转染的MCF-7细胞克隆形成数量明显少于对照组,抑制率达到84.1%。裸鼠体内实验结果显示,hTERT-siRNA转染组肿瘤生长速度也明显慢于对照组。结论hTERT-siRNA在体内外均显示可以有效、特异地抑制肿瘤细胞的生长。

RAD001对胃癌MKN-45细胞生长影响的实验研究

目的探讨RAD001对胃癌细胞株MKN-45细胞生长的影响及可能作用机制。方法体外培养MKN-45细胞,给予RAD001干预后通过细胞计数检测MKN-45细胞数目,流式细胞术检测细胞周期分布,Western-blot检测核糖体40S小亚基S6K蛋白激酶(p70S6K)、真核起始因子4E(eIF-4E)结合蛋白1(4E-BP1)、S6蛋白表达及磷酸化情况。结果RAD001作用于MKN-45细胞24 h:RAD001对MKN-45细胞的生长产生抑制作用,抑制作用具有时间依赖性;MKN-45细胞细胞周期发生改变,停滞在G0-G1期细胞比例增加;MKN-45细胞的4E-BP1、p70S6K、S6无明显变化,phosphate-p70S6K、phosphate-S6表达缺失,phosphate 4E-BP1表达下降。结论RAD001是通过抑制mTOR下游通路阻断4E-BP1及p70S6K的磷酸化和蛋白质翻译进而调节细胞周期以发挥抑制MKN-45细胞生长的作用。

cAMP依赖的蛋白激酶PKAR_(Iα)亚基在胃癌细胞中的表达及8-溴-环核苷酸对其表达及细胞增殖的影响

目的 观察经位点选择性 8-溴 -环核苷酸 (8- Br- c AMP)诱导前后 ,两株胃癌细胞 SGC790 1 和 MGC80 3 PKA RIα亚基m RNA的表达状况及癌细胞增殖动力学的变化。 方法 应用分子杂交技术测定 8- Br- c AMP诱导前后两株胃癌细胞 PKARIα亚基不同的表达状态 ;用 MTT法和流式细胞仪 FCM观察 8- Br- c AMP诱导前后 ,细胞增殖动力学的变化。 结果 两株胃癌细胞均有 PKA RIα亚基的高表达状态 ,而且经 8- Br- c AMP诱导后 ,PKA RIα的表达水平明显减弱 ;此外 ,8- Br- c AMP对两株胃癌细胞系 SGC790 1 和 MGC80 3 细胞有明显的抗增殖作用 ,其 IC50 值分别为 40μmol/ L和 15μmol/ L ;流式细胞仪分析结果显示 ,经 8- Br- c AMP诱导后 ,在正常的细胞倍体峰前出现一群凋亡的细胞峰型 ,可能和诱导后肿瘤细胞发生凋亡有关。 结论 胃癌细胞株存在 PKA RIα亚基的过表达状态 ,通过 8- Br- c AMP作用 ,可抑制 RIα亚基的过表达并可抑制癌细胞的恶性增殖。

负载Walker-256肿瘤细胞抗原的树突状细胞疫苗的制备

目的制备负载大鼠Walker-256肿瘤细胞抗原的树突状细胞(DC)疫苗,为进一步研究打下基础。方法从大鼠骨髓细胞中利用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介导素4(IL-4)在体外定向诱导分化出DC,以液氮冻融法制备肿瘤抗原刺激DC制备肿瘤疫苗。ELISA检测培养液中IL-12的浓度。结果得到大量具备典型光镜和电镜形态特征的DC,表达大鼠DC特异性标志OX62。负载抗原前后DC产生IL-12的水平存在明显差异(P<0.05)。结论负载Walker-256肿瘤抗原的树突状细胞疫苗制备成功,具有促进Th1极化的潜能。

上调miR-200a表达对人肝癌细胞MHCC97中边缘群细胞干细胞特性的影响

目的:探讨转染miR-200a mimics对人肝癌细胞系MHCC97中边缘群细胞(SP)干细胞特性的影响。方法:利用流式细胞技术从MHCC97细胞中分离出SP细胞。转染组为应用脂质体介导转染miR-200a mimics的SP细胞,对照组为未接受转染的SP细胞。采用实时荧光定量RT-PCR检测两组SP细胞miR-200a的表达情况。四甲基偶氮唑盐(MTT)和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖情况。Transwell小室检测细胞迁移能力。裸鼠成瘤实验检测细胞体外成瘤能力。结果:转染miR-200a mimics可明显上调SP细胞miR-200a的表达。MTT结果显示转染组SP细胞的增殖能力明显低于对照组(P<0.05),转染组软琼脂中克隆形成率(24.70±5.54)%明显低于对照组(51.63±7.11)%(P<0.05)。Transwell实验显示转染组细胞穿膜数为(18.52±4.27)个,明显少于对照组(63.34±7.41)个(P<0.05)。裸鼠成瘤实验中转染组成瘤数(1/8)也低于对照组(8/8)(P<0.05)。结论:上调人肝癌细胞系MHCC97中SP细胞miR-200a的表达,能够抑制SP细胞的增殖和迁移,降低体外成瘤能力,即抑制SP细胞的干细胞特性。

Apoptin引起肿瘤细胞G_2-M阻滞

目的 :研究凋亡素 (apoptin)特异诱导肿瘤细胞凋亡的作用 ,探讨其用于肿瘤治疗的可能性。方法 :用PCR技术克隆了apoptin基因 ,将其插入预先装有FLAG标签的真核表达质粒pcDNA3.1中 ,并构建了带有apoptin基因的腺病毒载体 ,观察转染pcDNA3.1/FLAG/apoptin和 /或Ad/apoptin重组腺病毒感染后apoptin在几种细胞中的表达及细胞形态的改变 ,用流式细胞术分析PI染色后Ad/apoptin感染细胞的DNA含量变化。结果 :apoptin在Hela、Bcap37、A5 4 9、HepG2、SKOV3等肿瘤细胞核中表达 ,apoptin重组腺病毒感染后细胞核染色质呈颗粒状 ,最后凝聚成不规则大块并出现核固缩。正向和反向插入apoptin的重组腺病毒均引起G2 M细胞增多 ,但前者引起G2 M阻滞更为显著 ,需要的感染复数 (MOI)也较低。结论 :apoptin可引起肿瘤细胞周期G2 M阻滞和染色质凝聚。

Alamar Blue法用于体外培养细胞活性检测的方法研究

目的 在比较Alamar Blue法与MTT法的基础上探讨Alamar Blue法用于测定细胞体外增殖及细胞毒实验的可行性。方法 采用Alamar Blue法及MTT法分别测定人肝癌细胞株SMMC-7721的体外增殖以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、顺铂、羟基喜树碱对该细胞株体外增殖的影响。结果 使用Alamar Blue法，接种人肝癌SMMC-7721细胞数在3．12×10^2-2×10^3／孔范围内时，细胞数与Alamar Blue还原率呈线性相关（r=0．9989），高、中、低三种细胞浓度组内差异分别为1．41％、3．88％、4．87％。使用MTT法接种人肝癌SMMC-7721细胞数在3．12×10^2-2×10^4／孔范围内时，细胞数与OD490-620值呈线性相关（r=0．9981），高、中、低三种细胞浓度组内差异分别为1．44％、4．07％、8．27％。结论 Alamar Blue法是一种简便、敏感、安全、经济的方法，可用于体外测定细胞增殖及化疗或免疫制剂的细胞毒作用。

外生型肝癌细胞系(EGHC-9901)的建立

目的 介绍外生型肝癌细胞系的建立及对其生物学特性测定的结果.方法 将手术切除的肿瘤标本进行体外培养,观察肝癌细胞形态学改变,进行核型分析、增殖动力学、流式细胞计数、裸鼠成瘤情况及AFP测定.结果 外生型肝癌细胞系(EGHG-9901)无论形态学观察,还是功能学测定,均符合肝癌细胞的一般特征,并具有体外分泌AFP功能.肝癌细胞之间形成完整毛细胆管,内有明显微绒毛.结论EGHC-9901细胞系符合外生型肝癌细胞系的特征.

不同来源骨髓基质细胞微环境对Jurkat细胞生物学特性的影响

目的观察正常及急性淋巴细胞白血病骨髓基质细胞微环境对Jurkat细胞生物学特性的影响。方法收集与正常及急性淋巴细胞白血病骨髓基质细胞微环境共培养10d的Jurkat细胞,观测Jurkat细胞增殖、细胞周期分布、凋亡、分化及DNR摄药量的改变。结果白血病骨髓基质细胞微环境对Jurkat细胞黏附、趋化及降低摄药量的作用强于正常骨髓基质细胞微环境;抑制增殖及促分化作用弱于正常骨髓基质细胞微环境。白血病骨髓基质细胞微环境抑制Jurkat细胞凋亡,而正常骨髓基质细胞微环境促进其凋亡。结论正常骨髓源基质细胞微环境较白血病源骨髓基质细胞微环境对Jurkat细胞具有更强的促进凋亡、分化及抑制增殖的作用,增加Jurkat细胞对DNR的敏感性。

NCI-H446人小细胞肺癌细胞株细胞亚群克隆与肿瘤干细胞的实验研究

目的探讨NCI-H446人小细胞肺癌细胞株细胞不同克隆细胞异质性机制与肿瘤干细胞的关系。方法采用有限稀释法克隆培养NCI-H446人小细胞肺癌细胞株细胞,免疫组化染色检测干细胞标志物CD133、ABCG2,流式细胞术测定各克隆细胞周期。结果15个单细胞克隆生长形成克隆,形态上大致分为2种克隆。克隆A共染色6片次,CD133、ABCG2表达阳性率为66.67%(4/6)、33.33%(2/6);克隆B共染色26片次,CD133、ABCG2表达阳性率为15.38%(4/26)、7.69%(2/26)。克隆A细胞处于G0/G1者多于克隆B,分别是70.13%和54.61%。结论NCI-H446人小细胞肺癌细胞株细胞存在异质性肿瘤细胞克隆,可能来源于肿瘤干细胞的分化。

人增殖抑制基因(hHSG)联合热处理对结肠癌细胞系HT-29的体外诱导凋亡效应

目的:观察人增殖抑制基因(human hyperplasia suppressor gene,hHSG)超表达联合热处理对结肠癌细胞株HT-29的细胞存活及其诱导凋亡的效应。方法:首先制备复制缺陷5型腺病毒-hHSG表达载体(Ad5-hHSG),然后将其在HT-29中超表达,观察Ad5-hHSG对肿瘤细胞的热增敏效应。采用细胞计数法检测其对细胞存活的影响,流式细胞术检测细胞凋亡和周期改变。结果:100感染复数(multiplicity of infection,MOI)剂量Ad5-hHSG与42℃加热1h联合应用后,活细胞数显著低于单用加热组和单用Ad5-hHSG组(P<0.01)。流式细胞术检测细胞凋亡,Ad5-hHSG单独作用组、单独加热组以及联合作用组细胞凋亡率均较对照组显著升高,而且联合作用组与单独作用组之间差异具有统计学意义(P<0.01)。细胞周期结果显示,Ad5-hHSG与42℃加热1h联合作用可明显导致HT-29细胞阻滞在G2/M期。结论:Ad5-hHSG对肿瘤细胞具有热增敏效应。

NF-κB、iNOS蛋白在结肠癌中的表达及其临床意义

目的探讨核转录因子-κB(NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白在结肠癌组织中的表达、相互关系及其与临床特征之间的关系。方法采用免疫组化PowerVisionTM两步法检测76例结肠癌组织中NF-κB、iNOS的表达情况。结果NF-κB、iNOS结肠癌组织中的表达率分别为57.89%(44/76),69.74%(53/76)。NF-κB、iNOS在结肠癌中的表达与肿瘤大小、分期及淋巴结转移有关,三者均与性别、年龄、肿瘤类型无关。在结肠癌中,NF-κB、iNOS表达具有相关性。NF-κB、iNOS阳性组微血管密度(MVD)高于阴性组MVD,两者比较具有统计学意义(P<0.05)。结论在结肠癌组织中,高表达的NF-κB与肿瘤的发生发展有关,而NF-κB调节下高表达的iNOS亦与肿瘤血管生成乃至转移密切相关。

丁酸钠诱导MCF-7细胞凋亡的研究

目的:观察丁酸钠诱导培养的乳腺癌细胞MCF-7凋亡的影响。方法:用终浓度分别为0、1.25、2.5、5.0、10.0mmol/L的丁酸钠处理MCF-7细胞48h,用MTT比色法分析丁酸钠对细胞的抑制率,倒置显微镜观察细胞生长情况的改变,流式细胞术,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)及DNA琼脂糖凝胶电泳检测凋亡。结果:不同浓度的丁酸钠对MCF-7细胞有明显的抑制作用,光镜下观察到细胞贴壁性随作用时间延长而下降;流式细胞术检测不同浓度丁酸钠处理细胞的凋亡率分别为4.8%、9.4%、26.1%和51.9%;TUNEL检测可见阳性细胞胞体缩小,核固缩,呈棕黄色或黄褐色颗粒;DNA琼脂糖凝胶电泳检测到10mmol/L处理细胞出现“DNA ladders”。结论:丁酸钠可以诱导MCF-7细胞发生凋亡。

Survivin反义RNA真核表达载体的构建

目的构建Survivin反义RNA表达载体,从基因水平靶向封闭Survivin功能,为探讨喉癌细胞凋亡和增殖的影响奠定基础。方法将Survivin大部分编码序列cDNA片段反向插入pEGFPC1载体,构建Survivin反义RNA表达载体。用脂质体转染技术将重组质粒转染人喉癌细胞株Hep2,并利用G418(300mg/ml的维持浓度)筛选,获得稳定细胞株(命名为HpEGFP/Survivin)。用蛋白免疫印迹Westernblot从蛋白质水平检测反义SurvivinRNA封闭Survivin的表达效果。结果构建的Survivin反义RNA表达载体(命名为pEGFP/Survivin),经酶切电泳和测序证实碱基序列的正确性。蛋白免疫印迹Westernblot结果表明,构建的Survivin反义RNA表达载体转染人喉癌细胞株Hep2,从蛋白水平抑制了Survivin的表达,抑制率为30%。说明反义SurvivinRNA载体构建成功。结论构建的Survivin反义RNA表达载体从蛋白水平抑制了Survivin的表达,可以进一步用于抑制Survivin基因表达的实验研究。

横纹肌细胞培养液对S-180细胞生长抑制作用的体外实验研究

目的:观察横纹肌细胞微环境对肿瘤细胞生长的影响,探讨横纹肌内转移瘤罕见这一现象的发生机制。方法:采用酶解法原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞和骨骼肌细胞,形态学和免疫酶染色方法检测横纹肌α-肌动蛋白进行细胞鉴定,免疫酶染色法进行细胞纯度鉴定,MTT法分析比较骨骼肌和心肌细胞细胞培养液对S-180细胞和正常肾小球系膜细胞的体外生长抑制作用,并运用胰酶消化法,热灭活法初步探讨横纹肌细胞培养液中抑瘤物质的理化性质。结果:S-180细胞与CMCM、MMCM共同培养后,细胞存活率明显下降,与DMEM相比差异均具有显著性(P<0.05),MCs细胞的细胞存活率无明显影响(P>0.05)。DDP对S-180细胞和MCs细胞均具有显著性抑制作用(P<0.05)。心肌细胞培养液和骨骼肌细胞培养液经胰酶消化后抑制活性仍然存在(P<0.05),经热灭活后活性消失(P>0.05)。结论:新生大鼠横纹肌细胞培养液对S-180细胞的增殖有明显的抑制作用;而对正常细胞的增殖无明显影响,与顺铂的抑制作用明显不同。横纹肌细胞培养液中有可能存在一种抑瘤物质,可能是横纹肌转移瘤罕见的关键因素。

β-榄香烯诱导LCC-2细胞凋亡及逆转TAM耐药性的机制

目的:探讨β-榄香烯诱导乳腺癌LCC-2细胞凋亡及逆转他莫昔芬耐药性的作用机制。方法:MTT法检测药物敏感性及耐药性逆转,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡百分率,免疫组化SP法检测Bcl-2、pS2蛋白的表达。结果:β-榄香烯降低他莫昔芬对LCC-2细胞的IC50(P<0.01),逆转倍数为3.6倍;影响细胞周期时相,明显增强他莫昔芬对LCC-2细胞的凋亡诱导作用,凋亡率由(2.17±0.16)%上升至(9.13±0.34)%,(P<0.01);降低LCC2细胞Bcl-2表达,表达率由(56.52±4.85)%降至(28.02±6.32)%;pS2为阴性表达。结论:β-榄香烯(β-elemene)可部分逆转LCC-2细胞的耐药性,其逆转机制主要是抑制Bcl-2的表达,诱导耐药细胞凋亡。

三氧化二砷对喉癌Hep-2细胞增殖的影响

目的观察三氧化二砷(As2O3)对喉癌Hep-2细胞株增殖的影响及细胞周期的改变。方法体外培养的Hep-2细胞与不同浓度的As2O3作用24、48、72小时,通过MTT还原法检测细胞的生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率并进行细胞周期分析。结果As2O3可有效抑制Hep-2细胞的生长,呈时间和浓度依赖性特点。2μmol/LAs2O3作用24h时,S期细胞比例增高,72小时后,S期细胞明显下降,细胞大量凋亡。As2O3在低浓度时,阻滞细胞通过S期,高浓度时诱导S期细胞凋亡。结论As2O3可抑制Hep-2细胞的增殖,与细胞周期阻滞有关。