稳定表达BCR／ABL的小鼠BaF3-P210细胞株的建立及其生物学特性的研究

目的构建能稳定表达BCR/ABL的小鼠转化细胞株BaF3-P210,并初步探讨BCR/ABL对BaF3细胞生物学特性的影响。方法将含有bcr/abl基因的逆转录病毒载体转染到包装细胞,收集病毒感染BaF3细胞,经筛选和亚克隆,获得稳定表达BCR/ABL的转基因BaF3-P210细胞。用PCR、DNA测序、RT-PCR和Westernblot检测bcr/abl基因在靶细胞中的整合和表达;用台盼蓝细胞计数法、流式细胞仪(FCM)和MTT法研究BCR/ABL对BaF3细胞生物学特性的影响。结果bcr/abl基因整合在BaF3细胞基因组中,BaF3-P210细胞能稳定表达bcr/abl基因及其蛋白。与对照组相比,BaF3-P210细胞增殖速度增快(P<0.05);G0/G1期细胞比例下降,S期和G2/M期细胞比例增高(P<0.05);经STI571处理后的细胞增殖抑制率为(54.08±1.90)%(P<0.05),早期凋亡率为(12.35±2.04)%(P<0.05)。结论成功构建的能稳定表达BCR/ABL的小鼠BaF3-P210转化细胞株具有增殖能力增强、细胞周期进程加速和对STI571敏感的恶性表型特征。

NADH对DENA所致L02细胞H-ras基因突变及c-erbB-2表达的影响

目的:研究还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)对二乙基亚硝胺(N-nitrosodiethylamine,DENA)诱变L02细胞过程中H-ras基因突变及c-erbB-2表达的影响。方法:聚合酶链式反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)法检测NADH对DENA所诱发的L02细胞H-ras基因突变的影响;Southern印迹法分析其对c-erbB-2基因表达的影响;RT-PCR法检测NADH对rasp21、c-erbB-2 mRNA表达水平的调控。结果:经NADH防护的DL02-Ⅲ细胞和DL02-B细胞的H-rasexon1突变率分别降至25.0%(3/12)和41.7%(5/12),与DENA致突变组相比,差异有统计学意义(P<0.05);Southern检测结果显示,NADH可下调由DENA所诱变的L02细胞中c-erbB-2基因的表达提高;RT-PCR检测结果提示,DENA诱变组细胞的rasp21、c-erbB-2 mRNA表达水平上调,而经NADH处理后,与DENA诱变组相比,可明显降低rasp21和c-erbB-2 mRNA表达水平上调的程度。结论:NADH抗突变作用的可能机制,与其在基因突变以及在转录水平对H-ras、c-erbB-2等相关癌基因的调控有关。

Survivin、Caspase-3和Bcl-2在肺癌中的表达及意义

背景与目的:细胞凋亡异常是肿瘤发生的原因之一。细胞凋亡是受凋亡控制基因调节,近来研究表明由于肿瘤组织分型不同,其凋亡调控基因的表达也存在差异。本研究旨在通过和细胞凋亡有关的基因蛋白生存素(Survivin)、Caspase-3和Bcl-2在小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达分布,对同一肿瘤,不同病理类型组织肺癌进行凋亡对比性研究,描述性分析在同一解剖部位、不同细胞学类型肿瘤组织中三种有关凋亡的基因蛋白表达的差异。方法:选取41例SCLC,30例NSCLC,采用免疫组化SP法检测肺癌组织中Survivin、Caspase-3、Bcl-2的表达水平和相关性。结果:SCLC中Survivin阳性表达率为29.3%,NSCLC为70%,两者表达分布差异有显著性(P<0.01);SCLC中Bcl-2阳性表达率为63.4%,NSCLC为30%,两者表达分布差异有显著性(P<0.05);SCLC的Survivin阳性患者中Caspase-3表达率为3/12例,阴性患者为62.1%(18/29),两者间差异有显著性(χ2=4.67,P<0.05)。NSCLC中Survivin阳性患者中Caspase-3的表达率为19.0%(4/21),阴性患者为88.9%(8/9),阴性患者Caspase-3的表达率显著高于阳性患者(χ2=12.80,P<0.01)。Caspase-3阳性表达在SCLC和NSCLC的表达分别为51.2%和40.0%,差异无显著性(P>0.05)。结论:在NSCLC中,Survivin表达上调,Bcl-2表达水平相对低下;在SCLC中,Bcl-2过表达,Survivin表达相对不高。Caspase-3在SCLC和NSCLC中的表达差异无显著性。由于组织学差异,SCLC和NSCLC的细胞凋亡过程可能存在不同的凋亡调节通路和凋亡调节因子。

诺帝对人卵巢癌细胞3AO和SKOV3增殖、周期及Aurora-A表达的影响

目的探讨抗肿瘤新药诺帝(Nordy)在体外对卵巢癌细胞(3AO黏液性癌,SKOV3浆液性癌)生长的抑制作用及对细胞周期的影响,同时对卵巢癌细胞株中Aurora-A的mRNA和蛋白过表达的抑制作用进行研究。方法MTT法检测诺帝对细胞增殖的抑制作用;RT-PCR和Westernblot检测Aurora-A的mRNA和蛋白表达情况;流式细胞术分析细胞周期。结果经诺帝作用后Aurora-A的mRNA及蛋白的表达水平显著下降(P<0.01);诺帝能明显抑制3AO、SKOV3细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期(P<0.05)。结论诺帝对卵巢癌3AO、SKOV3细胞的生长具有明显抑制作用,可以阻滞细胞周期。在诺帝多环节的抑癌机制中,抑制癌细胞株Aurora-A的异常高表达,阻止中心体的异常转变可能是其机制之一。

p53^(-/-),k-ras基因型小鼠肺癌细胞株的建立与鉴定

背景与目的:在肺癌的基础研究中,有特定基因变化的肺癌细胞株非常重要。k-ras激活和p53突变在肺癌的发生发展中有重要作用。本研究通过诱导小鼠肺癌生成,对肿瘤进行培养,建立p53-/-,k-ras基因型的小鼠肺癌细胞株。方法:用病毒吸入法,对p53loxp/loxp,Loxp-Stop-Loxpk-ras G12D转基因小鼠肺部细胞进行条件性基因敲除,诱导小鼠产生肺癌。通过HE染色和PCR法对小鼠肺癌组织进行组织病理学和基因型鉴定,对肿瘤细胞原代培养建立p53-/-,k-ras基因型的小鼠肺癌细胞株,并通过软琼脂克隆形成实验、生长曲线分析和核型分析对细胞株进行验证。结果:成功建立p53-/-,k-ras基因型的小鼠肺腺癌细胞株。p53-/-,k-ras基因型的小鼠肺癌细胞株体外生长速度与人肺腺癌细胞A549生长速度接近,能够在软琼脂中形成肉眼可见的克隆。结论:成功建立p53-/-,k-ras基因型的小鼠肺癌细胞株,为下一步的实验研究打下了基础。

miR-92a对人胃癌细胞株生物特性的影响及机制研究

目的探讨miR-92a对人胃癌细胞株生物特性的影响及可能的分子机制。方法在人胃癌细胞(SGC-7901)中瞬时转染miR-92a inhibitor,采用CKK-8法检测细胞株增殖情况,采用TUNEL方法检测细胞凋亡情况,采用Transwell迁移和侵袭实验观察细胞转移情况,并采用Western blot方法检测Bcl-2、Survivin蛋白表达情况。结果人胃癌细胞株在瞬时转染miR-92a inhibitor后,细胞增殖能力明显降低(P<0.05),凋亡明显增加(P<0.05),迁移和侵袭的细胞数量明显较少(P<0.05),Western blot检测结果显示Bcl-2、Survivin蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论 miR-92a可以促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭,抑制细胞凋亡,其可能通过调控Bcl-2、Survivin来促进胃癌的发生。

宫颈癌淋巴道转移模型的建立及Prox-1临床意义初探

目的建立小鼠宫颈癌淋巴道转移模型,初步探讨Prox-1的临床意义。方法将宫颈癌U27瘤株的单细胞悬液注入小鼠左爪垫,观察成瘤率、肿瘤生长及淋巴结转移情况。应用HE染色及CK免疫组化检测各级淋巴结中有无肿瘤转移;应用荧光定量PCR和Western blot检测肿瘤组织中VEGFR-3和Prox-1在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果爪垫种植后成瘤率100%;淋巴结转移程度与接种时间显著相关;荧光定量PCR和Western blot结果显示,肿瘤组织中Prox-1 mRNA和蛋白在远处淋巴结转移组[(0.000173±0.000085),(0.1087±0.0499)]明显高于前哨淋巴结转移组[(0.000058±0.000022),(0.0120±0.0057)]及无淋巴结转移组[(0.000027±0.000010),(0.0038±0.0014)],3组两两比较差异有统计学意义(P<0.05),而VEGFR-3的mRNA和蛋白在前哨淋巴结组分别为(0.000147±0.000066)和(0.1236±0.0548),与远处淋巴结转移组[(0.000224±0.000100),(0.1607±0.0753)]及无淋巴结转移组[(0.000134±0.000044),(0.0824±0.0432)]比较均无显著性差异(P>0.05)。结论小鼠爪垫皮下注射可成功建立宫颈癌淋巴道转移模型;Prox-1是预测肿瘤淋巴结转移及抗肿瘤淋巴转移的敏感指标。

沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:构建H-ras靶向短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)质粒,研究其对人涎腺腺样囊性癌裸鼠成瘤的抑制作用及其对移植瘤细胞增殖活性及细胞凋亡率的影响。方法:构建含H-ras靶向特定序列的真核表达质粒pHRAS,稳定表达pHRAS质粒的细胞为实验组,未处理的SACC-M细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型,计算成瘤率;移植瘤原代培养检测质粒表达及瘤细胞增殖活性;免疫组织化学法检测瘤内H-ras蛋白表达;采用组织学观察、流式细胞术及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。结果:pHRAS质粒转染组成瘤率及肿瘤体积显著低于对照组,原代培养可见大量瘤细胞表达绿色荧光。实验组瘤内H-ras蛋白表达量明显减少,实验组肿瘤细胞凋亡率为(41.55±4.25)%,明显高于对照组的(4.73±1.35)%(P<0.05)。结论:shRNA沉默H-ras基因能抑制SACC-M细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,在体内有效下调H-ras蛋白的表达,且对肿瘤细胞具有促凋亡作用。

携带siRNA-Stat3质粒减毒沙门氏菌对肝原位移植瘤的治疗作用

目的:观察携带有siRNA-Stat3质粒的鼠减毒沙门氏菌对小鼠肝脏原位移植瘤的治疗作用及效果。方法:将siRNA-Stat3质粒经电转化方法转入减毒鼠沙门氏菌中,将肝原位移植瘤小鼠分为mock未治疗组、pGC-Si-Stat3组和pGC-Si-Scramble组。pGC-Si-Stat3组小鼠灌胃转化有siRNA-Stat3质粒的减毒沙门氏菌,pGC-Si-Scramble组小鼠灌胃转化有空质粒的减毒沙门氏菌,未治疗组小鼠灌胃PBS,观察pGC-Si-Stat3组Stat3mRNA和蛋白表达水平。结果:与未治疗组和pGC-Si-Scramble组比较,携带有siRNA-Stat3质粒治疗组肝原位移植瘤体积明显缩小(P<0.05),瘤重减轻(P<0.05)。与其对应的mRNA和蛋白表达泳道光密度值较未治疗组和pGC-Si-Scramble组明显降低(P<0.01?。结论:携带有siRNA-Stat3质粒的鼠减毒沙门氏菌对小鼠肝原位移植瘤的生长具有显著抑制作用。

miR-195-5p稳定表达的膀胱癌T24细胞系的构建及其功能鉴定

目的:构建miR-195-5p稳定表达的膀胱癌T24细胞系,探讨miR-195-5p在膀胱癌T24细胞中的表达及高表达miR-195-5p对细胞生长的影响。方法:Real-time qRT-PCR(quantitative reverse tran-scription PCR)方法检测miR-195-5p在膀胱癌5637、T24、SW780细胞中的表达。通过构建pSilencer-miR-195-5p重组质粒,将其稳定转染至T24细胞,筛选miR-195-5p稳定表达细胞系。应用MTT实验和流式细胞术分别检测T24细胞高表达miR-195-5p对细胞增殖、凋亡的影响。结果:miR-195-5p在3种膀胱癌细胞系中普遍低表达,稳定转染的T24细胞具有miR-195-5p高表达特性,与对照细胞相比,其增殖活力和抗凋亡能力明显减低。结论:成功构建了能稳定表达miR-195-5p的T24细胞系,miR-195-5p高表达可以抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。miR-195-5p低表达可能参与膀胱癌发生发展。

建立BCR-ABL逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病模型的实验条件优化

目的 探讨构建BCR-ABL逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病模型最佳实验条件,以简化实验过程、节约成本并提高建模成功率.方法 不同剂量5-氟脲嘧啶（5-FU）注射受体鼠后观察骨髓中原始细胞占有核细胞百分比;纤维连接蛋白（FN）铺板后观察逆转录病毒感染效率的变化;分别用不同数量的骨髓细胞（0.2～0.6）×106个进行移植后通过形态学观察和荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization,FISH）鉴定移植小鼠成模状况.结果 研究剂量范围内5-FU量不影响骨髓原始细胞相对数量;纤维连接蛋白铺板后可使活细胞数量增加30%～50%,感染效率提高10%～20%;移植0.5×106个成功感染了BCR-ABL逆转录病毒的供体鼠骨髓细胞入受体小鼠即可成功建模.结论 优化后的实验条件简化了程序,节约了成本,大大提高了建模成功率,为相关研究提供了良好的实验参考.

^(188)Re(V)-DMSA与^(99m)Tc(V)-DMSA在肿瘤动物模型中的对比研究

目的:比较188Re(V)-DMSA(五价188Re-二巯基丁二酸钠)和99mTc(V)-DMSA在肿瘤模型体内生物分布与显像的特点,探讨188Re(V)-DMSA用于肿瘤治疗的可能性。方法:用188Re(V)-DMSA和99mTc(V)-DMSA对实验性实体肿瘤(小鼠艾氏腹水癌)模型进行生物学分布实验和全身平面显像,并通过脏器克组织百分摄取率(%ID?g)测定法和感兴趣区(ROI)技术进行定量分析,计算各时点两种放射性药物的靶?血(T?B)、靶?非靶(T?NT)比值。结果:两种放射性药物均主要浓聚于骨骼和肾脏,肿瘤组织也有较高的摄取,血液半清除时间均在1小时以内。平面显像中99mTc组T?NT的最大比值高于188Re组,但生物分布结果显示两种放射性药物T?B、T?NT的最大比值相比并无显著差异,且均在3.0以上。结论:188Re(V)-DMSA的生物分布特点与99mTc(V)-DMSA相似,在肿瘤及其转移灶的治疗方面有着很好的应用前景。

^(125)I-CEA人/鼠嵌合抗体rch24在裸鼠人结肠癌模型中的生物学分布

[目的]研究125I标记CEA人/鼠嵌合抗体rch24(125I鄄rch24)及淋巴瘤抗体IgG(125I鄄IgG)在荷人结肠癌裸鼠体内的分布,为放射免疫显像(RII)及临床应用提供依据。[方法]每鼠尾静脉注射抗体0.1ml(约100μCi),测定注射后24、48、96、168h肿瘤和血液、肝、肺等重要脏器的单位重量放射性比值(T/NT),各组织摄取百分比。[结果]125I鄄rch24注射后24～168h内,肿瘤部位出现选择性放射性浓聚;肿瘤组织在注射125I鄄rch24后,48h组织摄取百分比达到最大值28.06%;96h所有脏器T/NT比值均大于8.0;125I鄄IgG未出现放射性浓聚,呈全身分布。[结论]125I鄄rch24在荷人结肠癌裸鼠体内,可特异结合肿瘤组织,可望用于临床诊断和治疗。

^(131)Ⅰ-KDR单克隆抗体抑制荷人膀胱癌SCID小鼠瘤体生长的实验研究

目的 探讨 1 31 Ⅰ标记抗KDR单抗对SCID小鼠人膀胱癌皮下移植瘤模型瘤体生长的抑制作用。方法 在复制SCID小鼠人膀胱癌皮下移植瘤模型的基础上 ,用1 31 Ⅰ标记抗KDR单抗 3G9,尾静脉注射荷瘤SCID小鼠作为实验组 ,以非标记抗KDR单抗 3G9及生理盐水尾静脉注射荷瘤SCID小鼠作为对照组及空白组 ,观察 1 31 Ⅰ标记抗KDR单抗对SCID小鼠人膀胱癌皮下移植瘤模型瘤体生长的抑制作用。结果 1 31 Ⅰ 3G9尾静脉注射荷瘤SCID小鼠后 3周 ,移植瘤瘤体内癌组织可见大片坏死 ,对照组移植瘤瘤体内癌组织也可见部分坏死 ,与空白组相比实验组与对照组对瘤体生长大小的抑制率分别为 96.8%和 87.7%。结论 1 31 Ⅰ

VEGFR-3反义多肽的原核表达及其意义

目的:将血管内皮生长因子受体3胞外第二免疫球蛋白区(VEGFR-3 2-Ig)的反义基因在体外进行原核表达,并将产物进行生物活性鉴定。方法:构建VEGFR-3 2-Ig反义基因的原核表达载体,经过原核表达、亲和层析及蛋白酶切后获得VEGFR-3 2-Ig的反义多肽,用MTT法进行活性鉴定。结果:获得VEGFR-3 2-Ig的反义多肽,MTT法证明VEGFR-3 2-Ig的反义多肽具有较强生物学活性(细胞增殖抑制率可达68.7％)。结论:通过原核表达成功获得VEGFR-3的反义多肽,为研究和利用反义多肽提供了实验理论依据。

D-苧烯对人胰腺癌细胞法尼基蛋白转移酶、p21^(ras)膜结合的抑制作用的体外试验

目的探讨ｄ－艹宁烯在化学诱发实验性肿瘤及人实体瘤的防治作用及其机制。方法采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ方法观察了ｄ－艹宁烯对胰腺癌细胞中与膜结合的ｐ２１ｒａｓ蛋白表达和法尼基蛋白转移酶活性的抑制作用。同时，采用免疫组化法观察了ｄ－艹宁烯对ｐ２１ｒａｓ在细胞膜上定位的影响。并以Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ方法检测ｄ－艹宁烯对Ｈ－ｒａｓ癌基因在人胰腺癌细胞系中的表达。结果ｄ－艹宁烯对人胰腺癌细胞呈现的抑制作用，其机制可能与其抑制法尼基蛋白转移酶活性，从而降低ｐ２１Ｈ－ｒａｓ蛋白的异戊二烯化修饰有关。ｄ－艹宁烯可降低ｐ２１ｒａｓ蛋白的膜结合，增加胞浆ｐ２１ｒａｓ蛋白的积蓄。在经ｄ－艹宁烯处理过的胰腺癌细胞加入抗ｐ２１ｒａｓ抗体，采用免疫组化法也可观察到上述现象。结论法尼基蛋白转移酶的抑制和ｐ２１ｒａｓ蛋白膜结合与ｐ２１ｒａｓ定位的改变密切相关。ｐ２１ｒａｓ法尼基化的抑制作用改变了它在细胞内的定位，从而影响其生物学活性，但尚未发现与Ｈ－ｒａｓ癌基因表达的密切相关。

针对MAGE-1的pSUPERRNAi系统的构建

目的构建抑制MAGE-1的siRNA表达载体。方法化学合成2对编码短发夹RNA序列的、靶向MAGE-1基因的寡核苷酸链,各64个碱基,退火,克隆到经BglⅠ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上,重组构建RNAi质粒。通过双酶切鉴定及基因片段序列分析验证构建效果。结果重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。结论载体的成功构建,为进一步研究MAGE-1在肿瘤中的功能打下基础,可用于分析基因功能、肿瘤治疗等。

PPAR-γ的激动剂吡咯列酮抑制肝癌细胞生长的实验研究

目的观察PPAR-γ的激动剂吡咯列酮对肝癌细胞的生长抑制作用。方法采用MTT法研究了不同浓度盐酸吡咯列酮与肝癌细胞株SMMC7721的生长抑制作用,并观察了不同时间对SMMC7721的生长抑制作用。结果吡咯列酮对肝癌细胞有明显抑制作用,随着浓度的升高吡咯列酮对肝癌细胞的生长抑制作用逐渐增强;在高浓度组(20μM以上),在一定的时间范围内(24～120h)随着作用时间延长,抑制作用逐渐增强。结论PPAR-γ的激动剂吡咯列酮可抑制肝癌细胞的生长,并且呈剂量和时间依赖关系。

黏附分子CD44v6和E-cadherin结肠癌小鼠表达的实验研究

[目的]探讨正常小鼠组织与结肠癌(C26)小鼠黏附分子CD44v6和E-cadherin表达的关系。[方法]应用SP免疫组织化学方法检测结肠癌小鼠和正常小鼠组织中CD44v6和E-cadherin的表达情况,以组织标本的平均密度(MOD)表示。[结果]结肠癌小鼠组织中CD44v6的MOD为0.1103±0.0020,而对照组为0.0868±0.0187;结肠癌小鼠中CD44v6表达水平比正常小鼠对照组明显增强(P<0.01);结肠癌小鼠组织中E-cadherin的MOD为0.1100±0.0034,正常对照为0.1426±0.0015,结肠癌小鼠比正常小鼠明显降低(P<0.01),且CD44v6表达水平与E-cadherin表达水平呈负相关(P=0.000)。[结论]结肠癌的生长、侵袭可能与黏附分子异常表达相关,检测CD44v6和E-cadherin表达可作为判断结肠癌生长和侵袭倾向的参考指标。

miR-125b对肝癌干细胞自我更新能力的调控作用

目的观察miR-125b对肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)成球、克隆形成、增殖、凋亡、迁移的作用,探讨miR-125b对肝癌干细胞自我更新能力的调控作用。方法获取肝癌干细胞;包装表达miR-125b的慢病毒并感染肝癌干细胞;光镜计数法检测miR-125b对肝癌干细胞成球率及克隆形成率的影响;CCK-8法检测miR-125b对肝癌干细胞增殖能力的影响;DAPI染色观察miR-125b对肝癌干细胞凋亡的影响;Transwell实验检测miR-125b对肝癌干细胞迁移能力的影响。结果与对照组比较,miR-125b显著降低LCSCs的成球率(对照组27.7%,实验组0.0%,P<0.01)以及抑制其克隆形成能力(对照组29%,实验组6%,P<0.01);同时miR-125b可促进LCSCs的凋亡,抑制LCSCs的迁移能力(P<0.01)。结论 miR-125b对LCSCs的成球能力、克隆形成能力具有明显的抑制作用,表明miR-125b对LCSCs的自我更新能力具有负向调控作用。miR-125b也能抑制LCSCs的迁移,对LCSCs的凋亡具有促进作用。