食管癌细胞系CSEC的建立及其生物学特性

目的建立人食管癌细胞系为潮汕沿海地区食管癌研究提供实验模型。方法采用胶原酶消化法建立人食管癌细胞系CSEC。研究培养细胞的形态特点、生长特征、对Sc id小鼠的致瘤性、细胞遗传学特点及肿瘤相关标志物(AE 3、p53)的表达。结果细胞系CSEC在体外持续稳定生长超过13个月,已传至80代以上,群体倍增时间为39.6小时。CSEC细胞具有鳞状细胞的形态和结构特点,胞浆富含张力原纤维束,细胞间可见桥粒。Sc id小鼠移植瘤的组织学形态与患者的原发肿瘤一致。细胞系CSEC呈近四倍体核型,染色体结构改变常见而且复杂。肿瘤相关标志物(AE 3、p53)呈强阳性表达。结论人食管癌细胞系CSEC是一分化较高且生物学特性稳定的鳞状细胞癌细胞系,可为食管癌的发病机制和治疗研究提供有价值的实验模型。

三维无血清条件培养结合抗癌药物分离人骨肉瘤肿瘤干细胞

目的探讨无血清三维条件培养结合抗癌药物分离及鉴定人骨肉瘤肿瘤干细胞的可行性。方法将来源于人体的骨肉瘤细胞种植于1.2%藻酸盐凝胶中,并置于添加有阿霉素(Epirubicin,0.8μg/ml)的无血清DMEM/F12条件培养基中培养。培养7～10天后,可见凝胶内出现由单细胞增殖形成的单克隆球。取出该单克隆球,并通过细胞免疫荧光(Oct3/4和Nanog)、体内致瘤实验,检测该单克隆球细胞的生物特性。结果单克隆球主要由Oct3/4和Nanog阳性细胞组成,这些阳性细胞具有明显的致瘤作用。结论分离所得的单克隆细胞既能表达部分干细胞基因(Oct3/4和Nanog),又表现出明显的抗肿瘤药物性和体内致瘤性,三维无血清条件培养结合抗癌药物分离所得的单克隆骨肉瘤细胞可能为人骨肉瘤干细胞。

神经母细胞瘤原代培养及细胞类型意义的研究

目的:应用骨髓转移标本及原发肿瘤建立神经母细胞瘤原代培养细胞并鉴别N、S和I型细胞,根据细胞集落形成及特征经过提示不同种类细胞与神经母细胞瘤临床预后之间的关系。方法:应用体外原代培养技术对8例骨髓转移神经母细胞瘤患儿骨髓液及4例神经母细胞瘤手术切除肿瘤进行原代细胞培养,观察培养细胞形态学特点,应用Western blot法检测特异性标志物的表达以区分N、S和I型细胞,并应用细胞集落形成实验检测不同类型细胞所致集落形成情况,结合临床治疗及预后结果来评价N、S和I型细胞在神经母细胞瘤中的不同作用及对预后的指示作用。结果:N型细胞呈现聚集生长、核浆比例增大,轴突生长;S型细胞呈单层生长、胞体大而扁平,无轴突突起;I型细胞兼有以上两种细胞特点。I型细胞形成集落的数量高于N型细胞,而S型细胞并未形成集落。临床预后中N型及I型临床进展快,预后差,3年生存率为1/5及0(0/4);而S型临床有自发消退逆转迹象,预后良好,3年生存率为3/3。结论:神经母细胞瘤细胞类型包括N、S及I型,I型细胞具有肿瘤干细胞特点,可同时表达N及S型细胞的特异标志物且具有较强形成集落的能力,临床提示预后极差。N型细胞形成集落能力较I型细胞弱,且临床预后不良,而S型细胞无集落形成,临床预后良好。

可溶性人PD-1蛋白(shPD-1)对肿瘤患者树突状细胞功能的影响

目的检测shPD-1蛋白封闭肿瘤患者树突状细胞(DC)表面的PD-L1分子对DC功能的影响。方法体外诱导培养肿瘤患者DCs;观察给予或不给予shPD-1蛋白对DC的影响。应用流式细胞术检测DC免疫表型,采用MTT法检测DC刺激自体T淋巴细胞的增殖能力,采用ELISA法测定上清液中IL-12p70的水平,MTT法检测效应淋巴细胞对靶细胞的杀伤活性。结果封闭DC表面PD-L1分子后,DC刺激T细胞增殖,分泌IL-12p70能力显著提高,促进CTL杀伤反应的能力显著增强(P<0.05)。结论可溶性人PD-1蛋白(shPD-1)封闭DC表面PD-L1分子后,能显著提高DC活化T细胞的能力,促进DC诱导的抗肿瘤免疫反应。

稳定沉默黏着斑激酶结肠癌细胞株SW620的构建

目的 :构建稳定沉默黏着斑激酶(FAK)结肠癌细胞株SW620。方法:用构建好的FAK RNA干扰(RNAi)慢病毒载体pLL3.7 FAK及插入无沉默功能序列的阴性对照慢病毒载体pLL3.7,在293FT细胞中包装成慢病毒,感染体外培养结肠癌SW620细胞,作为实验组和阴性对照组,未感染病毒的SW620细胞作为未处理组,通过荧光倒置显微镜检测SW620细胞的感染效率,运用RT-PCR、Western blot方法测定FAK的表达情况,建立稳定转染细胞株。结果:成功包装了靶向FAK的RNAi慢病毒,感染效率>90%,稳定转染细胞株构建成功。RT-PCR及Western blot方法检测发现实验组与阴性对照组及未处理组相比,FAK的表达明显降低。结论:稳定沉默FAK的RNAi SW620细胞构建成功。

MDR1在人脑肿瘤干细胞中的表达及意义

目的:探讨脑肿瘤干细胞(BTSCs)上多药耐药基因1(MDR1)及其编码蛋白P-gp的表达,为抗癌治疗寻找靶向分子。方法:取10例胶质母细胞瘤患者肿瘤组织标本,制成单细胞溶液,接种于含EGF、bFGF、B27的无血清培养基中培养。分离获取BTSCs,对其传代培养,期间用Dispase消化分离获取到肿瘤干单细胞。免疫荧光方法检测BTSCs特异性标志物CD133,并用免疫组织化学和荧光的方法检测MDR1的表达。Western-blotting检测MDR1编码蛋白P-gp的表达。结果:所有的标本均培养出BTSCs,可在体外增殖和扩增分化,表达特异性的标志物CD133,通过免疫组织化学和免疫荧光结果提示,BTSCs上存在MDR1,MDR1在BTSCs的表达率为(45.3±5.4)%,Western blotting结果表明BTSCs上表达P-gp。结论:BTSCs表达MDR1,并且其上表达P-gp,这可能是使BTSCs更耐受化疗的原因之一。

稳定沉默CUL5基因的CNE2细胞系建立

目的:建立稳定沉默CUL5基因的CNE2细胞系,探讨CUL5在连续分割照射下鼻咽癌细胞加速再增殖现象中所起的作用。方法:设计并合成能表达针对CUL5基因的shRNA的DNA序列,构建真核表达载体;脂质体转染重组质粒至人鼻咽癌细胞株CNE2;G418筛选阳性细胞并扩大培养;RT-PCR检测连续分割照射前后阳性细胞CUL5基因沉默效果。结果:经限制性内切酶酶切和DNA测序证实质粒中插入的为所需序列;G418筛选所得阳性细胞经RT-PCR证实照射前后均能抑制CUL5基因表达。结论:成功建立CUL5基因沉默的CNE2细胞系。

干扰α烯醇化酶对耐药细胞株K562/A02耐药性的影响

目的肿瘤耐药的产生是肿瘤治疗失败的主要原因之一,α烯醇化酶(eno1)与肿瘤细胞耐药产生和发展密切相关。探究eno1对人慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/A02生长及耐药的影响。方法筛选3株稳定干扰eno1的细胞系K562/A02-sheno1和对照细胞系K562/A02-shcon;采用细胞计数法测定细胞生长速率,MTT法测定细胞增殖能力,细胞内罗丹明123含量测定细胞外排药物能力,real-time PCR反应测定基因mRNA表达水平,Western blot实验测定基因蛋白表达水平。结果与敏感性细胞株K562相比,eno1在耐药细胞株K562/A02中为高表达状态,其在mRNA水平和蛋白水平表达分别增高(2.85±0.56)倍和(1.43±0.05)倍;而K562/A02细胞生长速率与K562细胞相比差异无显著性。K562/A02-sheno1细胞系与对照组K562/A02-shcon相比生长速率降低,对抗肿瘤药物紫杉醇和阿霉素的敏感性均增强,且K562/A02-sheno1细胞系中罗丹明123含量也明显增高。K562/A02-sheno1细胞系中耐药相关基因MDR1表达水平降低。结论稳定干扰eno1表达能抑制K562/A02细胞生长,有效逆转K562/A02细胞耐药性,提高其对药物的敏感性,其机制与MDR1基因表达相关。

白血病K562细胞株中CD34^+细胞群的分离及其生物学特性

目的分离白血病K562细胞株中CD34+细胞群,并分析其生物学特征,为从干细胞角度治疗白血病提供实验依据。方法采用免疫磁性分选法分离K562细胞中CD34+细胞群,台盼蓝拒染法检测细胞活性;流式细胞术检测CD34+细胞比例及细胞周期;单细胞克隆培养检测CD34+细胞自我更新能力;RT-PCR法检测CD34+细胞分化相关指标促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)基因mRNA的转录水平;并检测CD34+细胞耐药蛋白P-gp(P-glycoprotein)的表达。结果免疫磁性分选法可有效分离出CD34+细胞群,细胞活性为99%～100%;分离的CD34+细胞含量占细胞总数的78.5%～85.3%,细胞大部分处于静止状态,G0/G1期细胞比例达80%左右,显著高于分离前的K562细胞;CD34+细胞群具有形成混合集落的能力;与K562细胞相比,CD34+细胞EPO和GM-CSF基因mRNA的转录水平明显下降(P<0.01),P-gp表达阳性。结论成功从K562细胞株中分离了CD34+细胞群,其具有自我更新和多向分化的能力,表明其具有白血病干/祖细胞的生物学特点。