黄曲霉毒素诱发大鼠肝细胞癌过程中细胞外调节蛋白激酶信号转导通路的动态变化

目的:探讨细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)信号转导通路在肝细胞癌(hepato-cellular carcinoma,HCC)发生、发展过程中的变化及其作用。方法:以SD大鼠为研究对象,随机分为空白对照组和实验组,实验组腹腔注射黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1),分别于实验第12、20、36和46周进行肝活检,58周时处死大鼠并剖腹获取肝组织及肿瘤组织,对所有标本均进行常规病理组织学检测后,采用RT-PCR和Western印迹法分别检测所获取组织中ERK1和ERK2 mRNA及蛋白的表达。结果:实验组46周时发现首只罹患HCC的大鼠,实验结束时实验组共有30只大鼠存活,其中24只大鼠发生HCC,6只大鼠无任何肿瘤发生;空白对照组11只大鼠均无肿瘤发生。RT-PCR检测发现,发生肿瘤、未发生肿瘤及空白对照组大鼠肝组织在实验不同时期的ERK1和ERK2 mRNA的表达水平无明显差异(P>0.05);但发生肿瘤大鼠的HCC组织ERK1和ERK2 mRNA表达水平较发生肿瘤前各时间点活检肝组织有明显上升(P<0.01),且较癌旁肝组织、同期无癌大鼠及空白对照组大鼠肝组织的表达明显上调(P<0.05)。Western印迹法检测结果发现,HCC组织p-ERK1及p-ERK2蛋白的表达较癌旁肝组织、发生肿瘤前各时期肝组织及无癌大鼠肝组织明显上升(P<0.01)。结论:在HCC发生早期ERK1和ERK2处于相对正常的状态,而在癌变期ERK1和ERK2信号转导通路表现出异常激活状态,提示ERK1和ERK2信号转导通路可能参与了HCC的发生与发展。

(RGD)_3-tTF融合蛋白选择性结合结肠癌裸鼠模型肿瘤血管的实验研究

背景与目的:肿瘤血管作为肿瘤分子靶向治疗的靶点受到广泛的关注,近年来有报道称利用抗体(Ab@作为组织因子(TF@胞外区截短组织因子(truncated tissue factor,tTF@的载体,表达的抗体--截短组织因子(Ab-tTF@融合蛋白能够选择性结合肿瘤血管,诱发实体肿瘤组织血管栓塞,导致肿瘤衰退,但是该方法存在一些弊端。本实验旨在研究以精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(GRGDSP,RGD@多肽作为tTF载体所表达的(RGD@3-tTF融合蛋白选择性结合结肠癌裸鼠模型肿瘤血管的能力。方法:用3个串联的RGD多肽与tTF合成融合基因(RGD@3-tTF,表达于大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli@BL21(DE3@,用镍柱纯化融合蛋白。用RGD-tTF融合蛋白作对照,通过凝血实验和凝血因子Ⅹ(FⅩ@活化实验检测(RGD@3-tTF融合蛋白的凝血活性,运用间接酶联免疫吸附试验(ELISA@方法分析其特异性结合肿瘤血管标志物整合素αvβ3的能力。结肠癌裸鼠模型分为3组(每组1只@,肿瘤组织分别用异硫氰酸荧光素(FITC@标记的(RGD@3-tTF、RGD-tTF融合蛋白、tTF进行荧光染色,免疫荧光实验分析融合蛋白在结肠癌裸鼠模型组织的定位。结果:(RGD@3-tTF融合蛋白保留了组织因子的凝血活性,在Ca2+存在时随着融合蛋白浓度的增加,凝血时间相应缩短,浓度为6μmol/L时,凝血时间为(9.96±0.56@min(与对照组比较,P<0.01@。(RGD@3-tTF融合蛋白的浓度在1μmol/L以上时能有效活化FⅩ,其活化能力与RGD-tTF相似(F=0.147,P>0.05@。同浓度(RGD@3-tTF融合蛋白与整合素αvβ3的结合能力强于RGD-tTF(F=164.81,P<0.01@,当融合蛋白浓度为0.24μmol/L时,(RGD@3-tTF融合蛋白和RGD-tTF融合蛋白的A405nm分别为1.25和0.95。免疫荧光实验显示,(RGD@3-tTF融合蛋白富集于结肠癌裸鼠模型的肿瘤血管。结论:(RGD@3-tTF融合蛋白在保留组织因子凝血活性的同时通过高效、特异地结合肿瘤血管标志物整合素αvβ3,选择性地定位在结肠癌裸鼠模型的肿瘤血管上,为发展tTF作为效应因子的结肠癌分子靶向治疗奠定了基础。

二氢青蒿素对人脑胶质瘤SHG44细胞辐射增敏作用及其机制的研究

为研究二氢青蒿素(Dihydroartemisinin)对人脑胶质瘤SHG44细胞辐射增敏作用及其机制,采用MTT法(Methyl thiazolyl tetrazolium)检测增殖抑制作用;应用克隆形成法检测放射增敏作用;运用流式细胞术检测二氢青蒿素及^(60)Coγ射线作用后细胞周期的变化;应用Western Blot技术观察细胞周期调控蛋白CyclinB1、Cdc2表达的改变。结果表明:二氢青蒿素对人脑胶质瘤SHG44细胞有增殖抑制作用,具有时间依赖性和浓度依赖性;二氢青蒿素(5μmol/L)能提高人脑胶质瘤SHG44细胞对γ射线的辐射敏感性,辐射增敏比(SER)为1.42;单纯照射组较对照组G_2/M期的细胞比例升高,二氢青蒿素+照射组较单纯照射组G_2/M期的细胞比例降低;二氢青蒿素+照射相对于单纯照射组,CyclinB1蛋白表达水平增加,Cdc2蛋白表达水平无明显变化。由此得出,二氢青蒿素对人脑胶质瘤SHG44细胞具有明显放射增敏作用,其机制可能是提高CyclinB1蛋白表达减弱G_2关卡作用,从而解除了照射引起的G_2期阻滞。

人ACHN肾癌裸鼠荷瘤模型建立及相关特性研究

[目的]探讨建立肾癌ACHN细胞系裸鼠皮下移植瘤及转移瘤模型的适宜条件。[方法]MTT法观察细胞生长情况。将裸鼠分组,分别用2.0×106/100μl(A组)、3.0×106/100μl(B组)和4.0×106/100μl(C组)的细胞接种浓度,注入裸鼠后项中间皮下;用4.0×106/100μl的细胞接种浓度,分别接种于裸鼠后项中间(C组)、背部(D组)和前肢腋窝皮下(E组);分别用第20代(F组),第30代(G组)和第10代(C组)的肿瘤细胞4.0×106/100μl,注入裸鼠后项中间,观察各组成瘤情况。尾静脉注射瘤细胞1.0×106/ml建立转移模型。[结果]第4天细胞进入对数生长期。A组成瘤率为33.3%、B组和C组的成瘤率均为100%,但C组的成瘤速度明显高于B组;C组、D组和E组的成瘤率均为100%,注射肿瘤细胞后第10天,C组、D组和E组的肿瘤生长平均相对体积,各组间尚无明显差异;注射后第30天,C组的肿瘤生长平均相对体积显著高于D组和E组(P<0.05);G组的成瘤率为83.3%,F组的成瘤率为100%,与C组相比,无显著性差异(P>0.05)。尾静脉注射组全部出现转移灶。[结论]使用ACHN细胞株,控制好浓度、接种部位以及传代次数后能获得较理想的裸鼠肾癌皮下移植瘤模型;使用传统尾静脉注射法可以建立裸鼠转移模型。

生长激素受体在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:研究人胃癌组织生长激素受体(GHR)的表达情况及其与肿瘤临床病理特点的关系。方法:回顾性分析100例胃癌病人资料,采用免疫组化法检测组织的GHR表达,分析其与肿瘤分化程度、病理分期、Borrmann分型的关系。同时检测其中14例癌旁正常胃黏膜组织的GHR表达情况,分析正常胃黏膜与肿瘤组织GHR表达的差异。结果:胃癌组织中GHR表达阳性率为55%(55/100),正常组织为85.7%(12/14)。GHR表达与临床分期、组织分化程度显著相关(P<0.01),与Borrmann分型相关(P<0.05)。GHR表达与肿瘤发生部位、性别和年龄均无相关性。结论:胃癌组织中GHR的表达存在差异。

白藜芦醇的抗结肠癌作用及其机制研究

目的:观察白藜芦醇对结肠癌SW480细胞生长抑制作用,并探讨其作用机制。方法:采用CCK-8试剂盒评价白藜芦醇对SW480细胞的增殖抑制效应;采用流式细胞技术检测白藜芦醇对SW480细胞的细胞周期和细胞凋亡影响;通过Tar Fis Dock分子对接分析工具,对白藜芦醇可能作用靶点进行预测分析。结果:白藜芦醇可明显抑制结肠癌SW480细胞的生长,白藜芦醇作用24 h时,其IC_(50)值为191.5μmol/L;而48 h时的IC_(50)值为117.6μmol/L。流式分析显示,白藜芦醇可使SW480细胞阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡。靶点预测分析筛选到10个白藜芦醇作用候选靶点,其中基质金属蛋白酶8(MMP8)、人组蛋白脱乙酰化酶2(HDAC2)、乙酰胆碱酯酶等3个靶点可能是白藜芦醇抗结肠癌的新靶点。结论:白藜芦醇具有良好的抗结肠癌效应,可能成为结肠癌治疗的新的候选药物或增敏剂。

白藜芦醇的抗肺腺癌作用机制研究

目的:采用生物信息学和系统生物学途径,研究白藜芦醇的抗肺腺癌作用机制。方法:从GEO数据库获取白藜芦醇处理肺腺癌的表达谱数据集(No:GSE9008),经质量分析和标化后,采用dchip软件筛选差异表达基因;采用GO注释工具对差异基因进行生物过程注释;采用Toppgene工具对差异基因进行信号通路富集分析;通过CMAP进行药物作用机制或药理作用预测分析。结果:对比白藜芦醇和乙醇作用于A549细胞的表达谱,获得116个显著差异表达基因,其中上调基因92个,下调基因24个;差异表达基因主要涉及细胞凋亡、黏附等生物学过程;白藜芦醇可能通过调节p53、DNA损伤修复、细胞外基质(ECM)糖酵解过程等信号通路而发挥抗肺腺癌作用;CMAP分析显示,白藜芦醇的抗肺腺癌作用与类雌激素或激素作用、抗炎作用、抑制微生物生长、Hsp90抑制作用等相关。结论:白藜芦醇的抗肺腺癌作用机制复杂,可能与其具有的抗炎、抗微生物、雌激素或激素效应等有关。

人结肠癌细胞株CW-2干细胞富集方法的比较

目的比较3种细胞分选方法对人结肠癌细胞株CW-2干细胞的富集效率,探讨获得肿瘤干细胞的有效方法。方法采用单纯无血清悬浮培养、无血清悬浮培养+奥沙利铂、无血清悬浮培养+奥沙利铂+流式细胞术(多重联合)分别富集人结肠癌细胞株CW-2干细胞;应用流式细胞术、NOD-SCID小鼠致瘤实验和Transwell侵袭实验比较3种方法的富集效率;分别测量不同时间点(4、7、9、14、21、28d)各组小鼠成瘤情况;免疫组化检测移植瘤中CD44和EPCAM的表达情况。结果无血清悬浮培养细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞和多重联合分选细胞中具有结肠癌干细胞特性的CD44+EPCAM+细胞,细胞比例分别为57.39%、73.85%、89.57%;多重联合分选细胞接种NOD-SCID小鼠后成瘤时间早、瘤体增长速度快,各时间点体积分别为(209.25±31.54)、(500.00±72.90)、(852.75±157.51)、(2280.00±440.91)、(4897.00±1154.15)、(11070.00±3559.86)mm3,与无血清悬浮培养细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞的成瘤能力比较差异有统计学意义(P<0.05);单纯无血清悬浮培养细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞和多重联合分选后细胞接种72h后穿过人工基底膜的细胞数分别为(98±7)/视野、(135±7)/视野、(188±6)/视野,3组之间差异有统计学意义(P<0.05);各组移植瘤中均表达CD44和EPCAM。3种分选方法所获得细胞中干细胞含量由高到低为:多重联合分选后细胞、无血清悬浮培养+奥沙利铂处理细胞、单纯无血清悬浮培养细胞。结论多重联合法富集肿瘤干细胞的效果明显强于单纯无血清悬浮培养和无血清悬浮培养+化疗药物法,是获得肿瘤干细胞较好的方法。

双调蛋白过表达促进小鼠肠癌CT26细胞的体内生长

目的:探讨上皮细胞生长因子双调蛋白(amphiregulin,AREG)对小鼠肠癌CT26细胞生长的影响及其相关机制。方法:采用ELISA法检测不同小鼠肿瘤细胞中AREG蛋白的表达水平。将携带AREG基因的重组慢病毒载体转染至小鼠肠癌CT26细胞、黑素瘤B16细胞和肝癌LPC-Akt细胞,同时以转染空载体细胞作为阴性对照。采用MTT法、克隆形成实验和FCM法分别检测AREG过表达后细胞的体外增殖和克隆形成能力以及细胞周期进程。构建AREG过表达CT26细胞的小鼠移植瘤模型,观察小鼠体内移植瘤的生长情况,并且采用FCM法和实时荧光定量PCR法分别检测移植瘤组织中免疫细胞的分布情况以及趋化因子的表达水平。结果:小鼠肠癌CT26、黑素瘤B16和肝癌LPC-Akt细胞中AREG相对低表达。过表达AREG后,上述3种肿瘤细胞的体外增殖能力、克隆形成能力及细胞周期进程均无明显变化(P值均>0.05)。然而,在CT26细胞的小鼠移植瘤模型中,AREG过表达可明显促进肿瘤细胞的体内生长(P<0.01),下调肿瘤组织中CD8^+T细胞所占比例(P<0.05),并降低与CD8+T细胞招募相关的CC趋化因子配体5(CC chemokine ligand 5,CCL5)的转录水平(P<0.05)。结论:AREG能够促进小鼠肠癌CT26细胞的体内生长,推测其作用机制可能与调控CD8+T细胞招募相关趋化因子,从而影响肿瘤微环境有关。

中肺合剂对S180肉瘤、Lewis肺癌荷瘤小鼠抑瘤作用实验研究

[目的]探讨中肺合剂对S180肉瘤、Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用,并初步探索其机制。[方法]采用S180肉瘤、Lewis肺癌移植瘤小鼠模型,分荷瘤阴性对照组、低、中、高剂量中肺合剂组和CTX阳性对照组,观察中肺合剂对两种荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用;运用EnVision免疫组化染色法观察中肺合剂对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤组织cyclinD1周期蛋白表达的影响。[结果]中肺合剂低、中、高剂量组和CTX组对移植性荷S180小鼠的抑瘤率分别为16.48%、29.73%、23.51%、41.87%;与阴性对照组相比,中肺合剂低、中、高剂量组和CTX组瘤重均有显著性差异(P<0.05)。中肺合剂低、中、高剂量组和CTX组对移植性荷Lewis肺癌小鼠的抑制率分别为22.33%、39.02%、25.48%、64.16%;与阴性对照组相比,低剂量组和高剂量组瘤重均有显著性差异(P<0.05),中剂量组和CTX化疗组瘤重均有非常显著性差异(P<0.01)。中肺合剂能下调Lewis肺癌小鼠肿瘤组织cyclinD1蛋白的表达水平,中、高剂量组阳性表达率与阴性对照组相比,有显著性差异(P<0.05)。[结论]中肺合剂对S180和Lewis荷瘤小鼠有明显的抑瘤作用,量-效关系呈抛物线型,其抑瘤作用可能与下调肿瘤组织cyclinD1蛋白表达水平有关。

凹顶藻萜类化合物对小鼠H_(22)肿瘤生长及VEGF、PCNA表达的影响

目的:观察凹顶藻提取物(Laurencia terpenoid extract,LET)对接种H22细胞小鼠的肿瘤生长及血管内皮细胞生长因子(VEGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法:昆明小鼠随机分为5组(10只/组),即模型组、LET低中高剂量组(25、50、100mg/kg·d-1)、环磷酰胺组(CTX对照组)。各组小鼠左前腋下皮下接种H22肝癌细胞,第二天除模型组外,其余4组分别以不同剂量的LET、CTX灌胃,于15天后处死,完整剥离出肿瘤,称重,计算抑瘤率。免疫组化法测定肿瘤组织中VEGF、PCNA的表达。结果:LET低、中、高剂量组小鼠H22肿瘤质量增长均较模型组缓慢(P<0.05),抑瘤率分别为27.5%、34.9%、41.4%;同时LET中、高剂量组VEGF阳性表达较模型组显著减少(P<0.05),低剂量组未见明显变化,但LET各剂量组PCNA阳性表达较模型组显著减少(P<0.05)。结论:LET各剂量组可以抑制小鼠H22肿瘤的生长,具有较高的抑瘤活性,且中、高剂量组能抑制VEGF的表达(P<0.05),低、中、高剂量组能抑制PCNA的表达(P<0.05)。LET对肿瘤组织VEGF、PCNA表达的抑制作用可能是其抗H22肿瘤及抗血管生成的一个重要原因。