目的克隆表达粉尘螨3类变应原(Der f 3)基因,并鉴定纯化蛋白的变应原性。方法取华南地区采集经实验室培养的粉尘螨(约500只)提取总RNA,经RT-PCR扩增Der f 3基因。将目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 3。大肠埃希菌...目的克隆表达粉尘螨3类变应原(Der f 3)基因,并鉴定纯化蛋白的变应原性。方法取华南地区采集经实验室培养的粉尘螨(约500只)提取总RNA,经RT-PCR扩增Der f 3基因。将目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 3。大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,表达Der f 3目的蛋白。重组rDer f 3蛋白经6His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,蛋白质印迹法(Western blotting)分析该纯化Der f 3蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE反应性,以鉴定重组Der f 3的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板克隆出Der f3基因,该基因与GenBank (D63858)公布的Der f3比较有4个核苷酸差异,但同源性为99.5%。E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后高效表达Der f 3重组蛋白,主要以包涵体形式存在。经Western blotting分析该重组蛋白Der f 3能与粉尘螨过敏患者血清的IgE反应,而不与健康者血清IgE反应。结论构建了华南地区粉尘螨3类变应原的原核表达载体,并高效表达和纯化出具变应原性的Der f3重组蛋白。展开更多
目的研究粉尘螨主要变应原Der f 2在螨体内的定位。方法采用免疫荧光抗原定位观察。先制备Der f 2单克隆抗体,再制作粉尘螨石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水,入3%H2O2孵育10 min,PBS漂洗后依次加入单克隆抗体血清37℃孵育1 h...目的研究粉尘螨主要变应原Der f 2在螨体内的定位。方法采用免疫荧光抗原定位观察。先制备Der f 2单克隆抗体,再制作粉尘螨石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水,入3%H2O2孵育10 min,PBS漂洗后依次加入单克隆抗体血清37℃孵育1 h、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶100)室温孵育60 min、抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶-异硫氰酸荧光素复合物(SABC-FITC)(1∶100)室温孵育60 min。PBS漂洗,伊文氏蓝处理切片5min,最后丙三醇封片。用抗重组Der f2单克隆抗体作一抗孵育,再选用抗鼠IgG荧光抗体为二抗,经荧光染色,观察Der f2在螨体内的位置。用正常小鼠血清(1∶100)代替小鼠单克隆抗体血清作为阴性对照。结果粉尘螨Der f2在中肠组织(包括中肠和后肠)和肠内容物均显示较强阳性,特别是肠内容物更明显。结论Der f 2分布于粉尘螨的中肠组织及其肠内容物。展开更多
文摘目的克隆表达粉尘螨3类变应原(Der f 3)基因,并鉴定纯化蛋白的变应原性。方法取华南地区采集经实验室培养的粉尘螨(约500只)提取总RNA,经RT-PCR扩增Der f 3基因。将目的基因克隆到pET-His表达载体上得到重组质粒pET-Der f 3。大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,表达Der f 3目的蛋白。重组rDer f 3蛋白经6His-tag蛋白纯化系统进行分离、纯化,蛋白质印迹法(Western blotting)分析该纯化Der f 3蛋白与粉尘螨过敏患者血清IgE反应性,以鉴定重组Der f 3的变应原性。结果以粉尘螨总RNA为模板克隆出Der f3基因,该基因与GenBank (D63858)公布的Der f3比较有4个核苷酸差异,但同源性为99.5%。E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后高效表达Der f 3重组蛋白,主要以包涵体形式存在。经Western blotting分析该重组蛋白Der f 3能与粉尘螨过敏患者血清的IgE反应,而不与健康者血清IgE反应。结论构建了华南地区粉尘螨3类变应原的原核表达载体,并高效表达和纯化出具变应原性的Der f3重组蛋白。
文摘目的研究粉尘螨主要变应原Der f 2在螨体内的定位。方法采用免疫荧光抗原定位观察。先制备Der f 2单克隆抗体,再制作粉尘螨石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡及梯度乙醇脱水,入3%H2O2孵育10 min,PBS漂洗后依次加入单克隆抗体血清37℃孵育1 h、生物素标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶100)室温孵育60 min、抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶-异硫氰酸荧光素复合物(SABC-FITC)(1∶100)室温孵育60 min。PBS漂洗,伊文氏蓝处理切片5min,最后丙三醇封片。用抗重组Der f2单克隆抗体作一抗孵育,再选用抗鼠IgG荧光抗体为二抗,经荧光染色,观察Der f2在螨体内的位置。用正常小鼠血清(1∶100)代替小鼠单克隆抗体血清作为阴性对照。结果粉尘螨Der f2在中肠组织(包括中肠和后肠)和肠内容物均显示较强阳性,特别是肠内容物更明显。结论Der f 2分布于粉尘螨的中肠组织及其肠内容物。