猪繁殖和呼吸综合征病毒基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因的克隆与鉴定

猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的基质膜（Ｍ）蛋白和核衣壳（Ｎ）蛋白是２种重要的结构蛋白。本试验根据ＰＲＲＳＶ美洲毒株的基因序列，设计了能够扩增Ｍ和Ｎ蛋白基因的１对引物，并在２个引物的两端分别加入ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点，经ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了一约９５０ｂｐ的目的基因片段，并将此基因克隆于ＰＢＶ２２０载体，构建了ＭＮ蛋白基因重组质粒ＰＢＶＭＮ，进一步由重组质粒回收ＭＮ基因片段亚克隆于ｐＳＫ＋（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋）测序载体，构建了重组质粒ＰＢＳＭＮ，经部分序列分析鉴定，重组质粒含ＭＮ蛋白基因。此基因的克隆为进一步研究该病毒ＭＮ蛋白免疫学特性及其分子基础和基因诊断技术奠定了基础。

应用电镜技术对一种丹顶鹤病毒的形态学观察

1982年,作者以3只急性死亡丹顶鹤的肝脏病料感染雏鹅和成年鹅,引起雏鹅和部份成年鹅发病,剖检发现死鹅和死鹤的病变相似。而且死鹤的肝脏病料还能使鹅胚死亡,使鹅胚原代成纤维细胞和鸭胚原代成纤维细胞产生明显的病变。本实验的目的是利用超簿切片技术对病毒讲行初步鉴定。并观察其形态及发生。

猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒 (porcinecircovirustype 2 ,PCV - 2 )全基因组序列 ,设计一对PCV - 2特异性引物 ,用该室分离的PCV - 2豫A株感染PK - 15细胞 ,从中提取PCV - 2复制型基因组DNA ,并以之为模板进行PCR扩增。回收PCR产物 ,构建重组测序质粒T -PCV - 2。测序结果表明 ,猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组为 176 7bp ,与GenBank收录的PCV - 2国外分离株核苷酸的同源性可高达 97%。序列分析表明 ,复制型豫A株的基因组包含 10个读码框架 ,其中ORF1、ORF2是其两个最主要的读码框架 ,分别编码 314、2 34个氨基酸。豫A株和PCV - 1间的ORF1、ORF2的氨基酸序列同源性分别为 85 %、6 6 % ,与其它PCV - 2毒株间的ORF1氨基酸同源性均在 98%以上 ,而ORF2的氨基酸同源性为 92 %～ 97%。

健康猪扁桃体和流产胎儿分离猪瘟病毒E2基因的序列分析

用RT-PCR技术对来自广西不同地区的120份健康猪扁桃体和84份流产胎儿材料进行猪瘟病毒检测,得到9份阳性病料,选取其中1份健康扁桃体和5份流产胎儿阳性材料进行猪瘟病毒E2基因克隆测序,应用DNAstar序列分析软件对6个广西毒株与HCLV、Shimen等国内外毒株进行同源性比较。结果显示,广西毒株之间核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为93.1%-99.6%和86.3%-99.2%,6个广西毒株E2基因的所有Cys位点都没有变异,可推测CSFV E2蛋白在抗原结构方面依然保持很高的稳定性;与标准毒株和疫苗毒相比,广西毒株在具有中和特性的B、C区域内721和724氨基酸位点发生了变异;遗传进化树分析表明,猪瘟病毒主要分为两大群和一个另类,广西株皆属于基因群,与我国的主要参考毒株HCLV、Shimen属于同一基因群,说明广西CSFV株与HCLV、Shimen变异不大。

猪瘟病毒持续感染与猪瘟预防控制

研究证明,在自然条件下,猪瘟病毒持续感染通常是在免疫力较低的情况下,由于环境中的病毒反复感染产生的,由于感染猪还有一定的免疫力,病毒虽然可以在其体内局部存留,但还不足以引起猪发病。一般情况下,感染猪虽然持续带毒,但不表现临床症状,然而却可以不断向外排毒,再次感染其他猪,污染环境;带毒的种猪可以通过母猪的胎盘和公猪的精液传播给仔猪,造成仔猪的先天免疫耐受,导致疫苗免疫失败。实验还证明,即使在良好的免疫状况下,反复多次人工感染猪瘟强毒也可造成持续感染。由此可见,猪瘟病毒持续感染是一个复杂的问题。

新疆部分地区牛轮状病毒VP6基因的原核表达与免疫反应性分析

为了原核表达牛轮状病毒VP6蛋白,检测该蛋白的反应原性,对牛轮状病毒内衣壳蛋白VP6保守区设计并合成引物,表达牛轮状病毒VP6蛋白,应用Western Blot分析该蛋白的反应原性。结果显示,利用PCR方法成功扩增出目的基因,经过测序与酶切鉴定,正确构建了表达载体pET-32a-VP6,SDS-PAGE电泳显示表达产物在60 k D表达重组蛋白。表明经过Western Blot检测,该蛋白具有良好的反应原性,为后续该蛋白作为诊断抗原奠定了基础。

重组马立克氏病病毒疫苗的研制现状

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)所致的马立克氏病是一种接触性及高度传染的鸡淋巴细胞增生病,临床以内脏淋巴瘤和神经损伤为特征,常接种CV1988/Rispens、SB1、301B/1和HVT-FC126等减毒或无毒疫苗株进行防治。这些疫苗株可诱导宿主产生细胞、体液和粘膜免疫应答,是一种理想的疫苗载体,可表达病毒和细菌的多种蛋白。这些疫苗包括禽流感病毒(rMDV-M2/HA/NA)、新城疫病毒(rMDV-F)、传染性法氏囊病毒(rMDV-VP2)、网状内皮增生病病毒(rMDV-LTR/env/GP90)、禽白血病病毒J亚型(rMDV-env/gag)、传染性支气管炎病毒(rMDV-S1)、传染性喉气管炎病毒(rMDV-gB/gJ)、火鸡疱疹病毒(rMDV-gB)、大肠埃希菌(rMDV-LacZ)和rMDV-IL-15等,本文综述以MDV为载体的病原体疫苗的研制现状。

猪源新城疫病毒JL01株分离鉴定及F基因遗传进化分析

2000年,在吉林省某猪场发生具有较高发病率和死亡率的急性传染病,发病率达到40%～50%,病死率15%,取其脾、肺、肾等组织进行电镜观察,可见副粘病毒样颗粒,表明其病原可能为某种猪源副粘病毒,命名为JL01株。在对该病毒的的血凝、血凝抑制等生物学特性进行鉴定后,初步确定该种猪副粘病毒为猪源新城疫病毒。病毒回归试验表明,纯化的病毒对猪仍有较强的致死性,并可从死亡猪体内分离到新城疫病毒。该病毒对鸡胚平均致死时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和半数致死量(EID50)分别为55.2h、1.60和10-7.5/0.1 mL,表明该毒株属于新城疫病毒强毒株。在此基础上,采用RT-PCR方法克隆了猪源新城疫病毒F基因,与其他10株NDV毒株进行序列比较分析,结果表明,JL01株与B1、LaSota、Clone30等经典的新城疫病毒弱毒株同源性较高(91.5%～98.5%),与ZJ1、Mukteswar等强毒株的同源性较低。F基因氨基酸裂解位点的序列为112G-K-Q-G-R-L117,与弱毒株序列完全相同。基因分型结果表明JL01株属于基因Ⅰ型。因此,本研究所分离到感染猪的新城疫病毒属于基因变异的新城疫病毒弱毒株,但其致病力与强毒株相当。

NP基因特异性干扰RNA抑制H5N1高致病性禽流感病毒复制的研究

目的设计针对H5N1高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因的干扰RNA(siRNA),研究其在细胞水平抑制病毒复制的效果。方法根据siRNA设计原则,设计并合成3对靶向HPAIV NP基因的siRNA,构建表达性质粒(ps-NP732、ps-NP863、ps-NP1344),分别转染MDCK细胞并攻毒,通过病毒滴度测定r、eal-time PCR、间接免疫荧光试验和Western blot,检测siRNA抑制AIV复制的效果。结果设计的3对siRNA中,ps-NP863明显抑制AIV复制,病毒滴度与对照组相比降低31倍,real-time PCR、间接免疫荧光试验、Western blot结果与病毒滴度测定结果相符,而ps-NP732和ps-NP1344无抑制AIV复制作用。结论构建的ps-NP863可显著抑制HPAIV复制,为开发抗AIV治疗制剂和动物机体抗AIV研究奠定了基础。

2010年山东省环境污水中脊髓灰质炎病毒的监测及其基因特征分析

本研究在山东省开展了脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）的外环境监测,从济南、临沂两地采集污水标本,浓缩处理后进行病毒分离,对分离到的PV采用中和试验进行血清定型,并对其VP1及3D区进行序列测定,分析其基因突变和重组情况。2010年,共采集污水标本32份,PV阳性10份,阳性率31.3%;分离到18株PV（PV1型3株,PV2型9株,PV3型6株）,均为疫苗相关株,VP1完整编码区核苷酸变异数在0~4个之间,在3株PV2型病毒和4株PV3型病毒的基因组中发现重组;对VP1区影响神经毒力的减毒位点分析发现,PV1型病毒中有1株在nt 2 749发生突变（A→G）,PV2型病毒中有1株在nt2 908发生A→G突变,3株在nt2 909发生U→C突变,6株PV3型病毒全部在nt2 493发生C→U突变。环境污水中可以分离到PV,其基因重组率和主要减毒位点的回复突变率较高,未发现脊灰野毒株和疫苗衍生株脊灰病毒（Vaccine-derived poliovirus,VDPV）。

牛传染性鼻气管炎病毒gC结构蛋白的真核表达及其反应原性分析

目的真核表达牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gC结构蛋白,并对其反应原性进行鉴定。方法以GenBank中登录的IBRV基因序列合成gC基因全长,构建重组真核表达质粒p CDNA4-gCHis,并进行双酶切鉴定。将鉴定正确的质粒转染MDBK细胞,收集上清,镍柱纯化带有His标签的重组gC蛋白,经Dot blot和间接免疫荧光法鉴定其反应原性。结果质粒p CDNA4-gC-His经双酶切鉴定证明构建正确,表达的重组gC蛋白相对分子质量约54 000,纯化后的浓度为0. 03 mg/mL,可与IBRV免疫的兔多抗发生反应。结论成功构建了真核表达质粒pCDNA4-gC-His,并能在MDBK细胞系中正确表达,表达的蛋白与天然IBRV gC蛋白具有相同的反应原性,为后续免疫学诊断方法的建立奠定了基础。

非结构蛋白在非洲猪瘟病毒感染中作用

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、出血性猪传染病,给疫情发生国家(地区)的养猪业造成重大经济损失。ASFV为双股DNA病毒,基因组含有150~167个开放阅读框(ORFs),可编码150~200种蛋白质,其中非结构蛋白有100余种。ASFV编码的酶、转录因子、调节宿主细胞功能蛋白和病毒免疫逃逸相关蛋白等作为重要的非结构蛋白,在病毒核苷酸代谢、DNA复制、修复、转录、蛋白修饰以及病毒与宿主细胞相互作用等过程中发挥重要作用,但仍有许多非结构蛋白的功能尚不明晰。因此,本文综述了ASFV非结构蛋白在病毒感染中的作用,以期为ASFV非结构蛋白的进一步研究提供参考。

2017年国内大型鸡场分离的H9N2禽流感病毒的遗传进化和分子特征分析

H9N2禽流感病毒自1994年在广东首次报道暴发以来,已在国内广泛地流行,给养禽业带来了极大的损失,甚至威胁着人类的健康。为了解2017年国内H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化和分子特征变化,本研究从江苏、安徽、山东等地区的大型鸡场中分离到了10株H9N2亚型禽流感病毒。对10株分离株的基因分析表明,所有分离株均属于在2013年后占主导地位的G57型,由BJ/94系的HA、NA和NS基因,DK1系的PB2基因,F/98系的PB1,PA和NP基因以及G1/97系的M基因的四重组病毒组成,并且分离株的EID50显著低于早期分离的H9N2禽流感病毒。10株分离株中有7株受体结合位点的198位发生了A到T,或者A到V的替换,并发生糖基化位点在218位的缺失,313位的增加。与近5年已经发表的流行株HA蛋白比较,所有分离株的抗原位点均发生了S127R、S183N、D216E、T220I、Q235M、S283R突变,NA基因在61~63位缺失NIT;表明分离株的抗原发生了变异。而分离株内部基因PB2上的K318R突变,PB1上的L13P突变,PA上的K356R突变、Q/T/S400P突变,NS上的E227K突变,NP上的D34S、K398Q突变,M1上的V15I突变以及M2上的I28V、L55F突变,使分离株更易感染哺乳动物,说明必需要继续加强H9N2禽流感病毒的监测,密切关注其对人类可能造成的影响。特别是10株分离株中首次出现的NA基因的E433D突变和PB2基因的E627V突变是否会给H9N2禽流感病毒增加新的生物学特性还有待进一步研究。