丹参4-(5′-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶的cDNA全长克隆及其诱导表达分析

本文首次从丹参毛状根中克隆得到了丹参4-(5′-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(简称为SmCMK)的编码基因的全长cDNA序列,GenBank注册号:EF534309。KEGG软件分析表明:SmCMK位于二萜类化合物生物合成的上游途径——非甲羟戊酸途径(DXP),是DXP途径上唯一的激酶。所克隆的SmCMK基因序列全长1 493 bp,包括完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),推测编码396个氨基酸的多肽,分子质量为43.302 kDa,等电点(pI)值为6.78;含有71 bp的5′非转译区(5′UTR)和232 bp的3′非转译区(3′UTR)。末尾具有完整的AATAA加尾信号和PolyA结构,说明所克隆基因的序列较为完整。经序列比对分析表明,SmCMK与其他植物CMK激酶家族具有较高的同源性。实时荧光定量PCR结果显示该基因受茉莉酸甲酯(MJ)诱导后表达水平显著升高,与丹参酮类成分含量受MJ诱导后的增加趋势一致,初步证明了SmCMK基因表达量与丹参酮类成分的积累之间的关系,为进一步研究丹参酮类成分的次生代谢调控机制奠定了基础。

金铁锁鲨烯合酶cDNA的克隆和功能鉴定

濒危药用植物金铁锁(Psammosilene tunicoidesW.C.Wu et C.Y.Wu.)的有效成分三萜总皂苷有显著的药理活性。为克隆和鉴定金铁锁三萜皂苷生物合成途径中的关键酶基因——鲨烯合酶的全长cDNA,本研究采用同源兼并引物PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆了其全长cDNA;结合大肠杆菌异源表达、体外酶促反应及针对产物化学结构的GC和GC-MS分析等方法鉴定了其功能。研究结果表明:金铁锁鲨烯合酶cDNA全长为1 663bp,含有1 245 bp的开放阅读框(ORF),编码414个氨基酸(计算分子质量为47.69 kD),5′非编码区(UTR)和3′UTR分别为260 bp和158 bp,GenBank注册号为EF585250,与三七、人参和甘草的鲨烯合酶的氨基酸序列有较高的同源性,分别为83%、82%和82%,而与裂变酵母、白色念珠菌和人的氨基酸序列的同源性分别只有35%、39%和47%;表达产物具有催化两分子法呢烯焦磷酸连接成鲨烯的活性。本研究克隆和鉴定了金铁锁鲨烯合酶的全长cDNA,为金铁锁次生代谢工程研究提供了重要基础。

利用基因转化提高虎杖毛状根中活性成分的含量

通过转白藜芦醇合酶（resveratrol synthase，RS）基因提高虎杖毛状根中主要活性成分——白藜芦醇（resveratrol，RE）和白藜芦醇苷（polydatin，PD）的含量。用改进的高盐低pH法提取葡萄基因组DNA，通过PCR扩增获得RS基因序列，构建表达载体pCAMBIA1300—35S—RS，然后采用冻融法转化发根农杆菌ATCC11325，继而浸染划伤的虎杖无菌幼苗叶片，PCR和RT—PCR法鉴定RS基因在虎杖毛状根中的整合与表达，高效液相色谱（highly effective liquid chromatography，HPLC）法测定转基因毛状根中RE及PD的含量。首次成功诱导获得转RS基因虎杖毛状根，经鉴定该基因已在虎杖毛状根中得到整合与表达，RE和PD的含量分别为17～187μg·g^-1DW和836～1970μg·g^-1 DW，而未转基因虎杖毛状根中RE和PD的含量分别为0～130μg·g^-1 DW和190～320μg·g^-1 DW。在所选取的不同根系中，转基因毛状根PD的含量均得到显著提高，最高含量是未转基因毛状根的5倍，而RE含量提高不显著。

CYP3A5和MDR1基因多态性与肝移植病人他克莫司浓度／剂量比的关系

目的研究肝移植术后患者的细胞色素P4503A5酶(CYP3A5)和多药耐药蛋白(MDR1)基因多态性对他克莫司浓度/剂量比的影响。方法记录患者的体重、他克莫司剂量和血药浓度等指标,采用聚合酶链式反应-限制性内切片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对肝移植患者进行基因分型,比较不同基因型患者之间他克莫司的浓度/剂量比。结果CYP3A5*1/*1和*1/*3型患者的他克莫司浓度/剂量比明显低于*3/*3型患者(P<0.01),MDR1的3435和2677位点各基因型分组之间无明显差异(P>0.05)。结论CYP3A5基因*3多态性与他克莫司血药浓度/剂量比具有显著相关性,*1/*1和*1/*3型的患者拟取得相似的血药浓度要比*3/*3型患者服用更高剂量的他克莫司,用药前检测基因型可以更有效地对他克莫司进行剂量调整。

SARS冠状病毒未知功能小蛋白大肠杆菌表达及条件优化

将人工合成的SARS-CoV三个未知功能小蛋白X4、X5和ORF10的编码基因克隆到载体pET32a中,构建其表达载体。再将这些表达载体转入大肠杆菌中进行表达,SDS-PAGE和Western blotting结果证明,X4、X5和ORF10三个基因在大肠杆菌中均获得表达。分别研究了温度、IPTG浓度、IPTG加入时间和诱导时间对重组蛋白表达的影响。通过正交分析,得到了上述三种重组蛋白的优化表达条件。根据最佳条件表达重组蛋白,获得重组蛋白占总蛋白的百分比分别是:X4,20%;X5,27.8%;ORF10,68.5%。

壳聚糖-hVEGF_(165)基因微粒的制备及体外转染的实验研究

采用复凝聚法制备壳聚糖-hVEGF165基因微粒,观察微粒形态,测定微粒的粒径、基因包封率和载药量,以LipofectamineTM2000转染试剂作为阳性对照,检测微粒对心肌细胞的转染活性及对心肌细胞存活率的影响。结果表明,微粒形态多呈球形,粒径小,基因包封率和载药量均较高,转染活性略低于脂质体,但微粒对心肌细胞的毒性明显低于脂质体。

原花青素对脑缺血后抑凋亡基因蛋白Bcl-2和促凋亡基因蛋白Bax的影响

目的:观察原花青素对局灶性脑缺血大鼠大脑皮质抑凋亡基因蛋白Bcl-2和促凋亡基因蛋白Bax表达的影响,并分析该影响是否存在剂量依赖性。方法:实验于2004-11/2006-01在锦州医学院药理实验室和免疫组化实验室完成。①选用健康成年SD大鼠30只,雌雄各半,体质量200～250g。②按随机抽签法将大鼠分为5组:假手术组,模型组,原花青素低、中、高剂量组,每组6只。除假手术组不插入线栓外,余下各组均以线栓法阻塞大鼠右侧大脑中动脉,制成局灶性脑缺血模型。以大鼠即刻出现右侧Horner征为造模成功。原花青素低、中、高剂量组:于术前2周分别按100,200,300mg/kg剂量灌胃原花青素混悬液(原花青素粉剂,由天津尖峰天然产物研究开发有限公司提供,批号:20040719),1次/d,共2周,并于术前1h再灌胃1次。假手术组和模型组:于术前2周灌胃等量生理盐水。③术后24h用免疫组化SABC法染色统计大脑皮质每高倍镜视野Bcl-2和Bax表达阳性细胞数。④多组间计量资料差异比较采用单因素方差分析检验,两组间比较采用LSD检验。结果:大鼠30只均进入结果分析。①大鼠大脑皮质Bcl-2阳性细胞数:原花青素低、中剂量组分别为(34.33±8.16)和(31.44±7.09)个,比模型组[(15.72±5.03)个]分别增加了118%,100%,差异明显(P<0.01);原花青素高剂量组与模型组相近[(16.33±5.48)个,P>0.05];原花青素低、中剂量组间差异不明显(P>0.05)。②大鼠大脑皮质Bax阳性细胞数:原花青素低、中剂量组分别为(11.83±4.57)和(12.56±4.31)个,明显少于模型组[(20.5±4.40)个,P<0.01];原花青素低、中剂量组间差异不明显(P>0.05);原花青素高剂量组与模型组相近(P>0.05)。结论:中、小剂量(100,200mg/kg)原花青素可对局灶缺血性脑损伤起到预防性保护作用,其保护作用发生可能与提高Bcl-2表达、抑止Bax表达有关。

DNA疫苗的研究现状

DNA疫苗的概念提出已有十几年的时间,其间针对DNA疫苗的研究工作取得了很大进展,其有效性已在动物体内得到了验证,而且部分疫苗已进入临床试验阶段,但在取得进展的同时也遇到了许多制约其发展的难题。本文对DNA疫苗发展现状,遇到的问题,采取的策略及可能引起的副反应加以综述。

TAT-NDPK-A蛋白的构建表达及穿膜初步研究

目的构建pET-TAT-nm23-H1质粒,表达TAT-核苷二磷酸激酶A(TAT-nucleoside diphosphate kinase A,TAT-NDPK-A)融合蛋白,并研究融合蛋白穿膜进入A549细胞。方法人工合成编码TAT蛋白转导区域的11个氨基酸序列于NDPK-A引物的上游,PCR扩增后将融合基因克隆到pET28(a)原核表达载体上,经IPTG诱导表达、镍离子树脂色谱纯化TAT-NDPK-A蛋白,Westen-blot鉴定分析重组蛋白的抗原性,将TAT-NDPK-A蛋白加入到A549细胞中,荧光免疫组化检测蛋白穿膜进入细胞内。结果TAT序列与NDPK-A正确融合并插入pET28(a)载体上,经诱导表达纯化成功获得纯度为97%的TAT-NDPK-A蛋白,在培养的A549细胞中加入重组蛋白4 h后在细胞内检测到穿膜的蛋白。结论构建表达TAT-NDPK-A蛋白,TAT序列能够引导重组蛋白穿过细胞膜进入细胞内,为进一步研究基因的功能奠定了基础。

重组人酸性成纤维细胞生长因子的稳定性研究

目的研究重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)在不同温度下的存放稳定性。方法rhaFGF冻干粉和溶媒在4,25和37℃分别保存30个月;rhaFGF液体在4℃保存56d,在25和37℃分别保存35d。采用MTT法测定rhaFGF的生物活性,同时进行外观性状、水分含量、pH值的测量和无菌试验。结果4℃时,rhaFGF冻干粉、液体和溶媒的各项性质在观察期内都无变化。25℃时,rhaFGF冻干粉、液体的生物活性分别在存放18个月和35d有下降趋势。37℃时,rhaFGF冻干粉、液体的生物活性分别在存放12个月和35d有下降趋势。结论rhaFGF冻干粉在4℃时可有效保存2年;rhaFGF冻干粉溶解后于4℃时保存28d内使用有效;溶媒在4℃时保存2年质量稳定。

慢病毒载体包装与生产方法

慢病毒在多种疾病的基因治疗中作为理想的基因转移载体,然而慢病毒滴度不高的问题严重影响慢病毒载体在基因治疗中的推广应用,本文从慢病毒质粒提取、病毒包装、细胞培养、病毒纯化等方面对提高慢病毒滴度的研究现状做一综述。

透明质酸/聚酰胺-胺三元纳米基因复合物的构建及其体外评价

目的在聚酰胺-胺(polyamidoamine,PAMAM)树状大分子与DNA形成复合物的基础上添加透明质酸(hy-aluronic acid,HA)形成三元纳米复合物,研究其基因递送性能的改变。方法配制不同电荷比的三元纳米复合物,测定其粒径和电位;选择MCF-7和MDA-MB-231细胞进行转染效率的测定,选择B16和MCF-7细胞进行细胞毒性的测定。结果和结论形成的三元纳米复合物大小均一,结构稳定。与单纯的PAMAM载体相比,增加HA提高了转染效率,降低了细胞毒性,适合用于基因的递送和转染。

乳酸钠对大鼠的亚慢性经口毒性试验

目的观察大鼠连续经口给予乳酸钠后的毒性靶器官及其损害的可逆性。方法60只SD种大白鼠随机分为3个组,每组10只雌性和10只雄性大鼠,3组大鼠经口灌胃分别给予0、800、2000mg.kg-1乳酸钠,给药体积1mL/100g,连续经口染毒90天。于第7周、第13周和恢复4周,每组剖杀部分大鼠做血液学、生化学、眼科、尿液检查,脏器湿重值、脏器系数值和解剖病理学观察。结果染毒各期高剂量组的血清生化学检查显示钠离子、钙离子数值升高,钾离子、氯离子数值降低;尿液检查发现尿比重(SG)数值降低,尿蛋白质(Pro)和尿胆红素(Bil)数值升高;解剖病理学发现7只大鼠膀胱腔内存在轻度蛋白样物质聚集;血清生化学检查低剂量组的钠离子和钙离子数值升高、恢复期高剂量组的钠离子数值仍然较高。结论乳酸钠能引起大鼠各期血液的无机离子和尿液蛋白出现明显的变化,对大鼠有一定毒性作用。

bFGF生物蛋白海绵体外生物学活性检测方法的建立及其稳定性评价

目的:建立碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)生物蛋白海绵体外生物学活性测定方法,观察bFGF生物蛋白海绵常温放置的稳定性。方法:bFGF生物蛋白海绵供试品融于稀释液中,离心后获得浸提液,以bFGF标准品为对照,与NIH3T3细胞共培养,MTT法检测bFGF生物蛋白海绵浸提液对NIH3T3细胞的促增值作用,用bFGF标准品计算bFGF生物蛋白海绵的相对百分效价,对该方法进行验证;以常温储存2、3和4年的bFGF生物蛋白海绵为供试品,以低温储存30d的bFGF生物蛋白海绵为标准对照,以不含bFGF生物蛋白海绵和bFGF的培养液为空白对照,测定各组生物学活性效价,比较不同储存时间bFGF生物蛋白海绵的体外生物学活性效价的稳定性。结果:bFGF生物蛋白海绵供试品浸提液随浓度增加其吸光度(A值)增高,即NIH3T3细胞增殖作用增加,与空白组比较差异有统计学意义(P<0.01),与bFGF标准品比较差异无统计学意义(P>0.05);bFGF标准品和bFGF生物蛋白海绵在该方法中均存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)∕[1+(X/C)B]+D;常温条件下储存2、3和4年生物蛋白海绵体与低温储存30d比较,其生物学活性效价(U.mL-1)下降率分别为0.5%、0.6%和0.8%,均低于15%的国家标准。结论:bFGF生物蛋白海绵在体外能够促进NIH3T3细胞增殖,具有良好生物学活性;应用NIH3T3细胞检测bFGF生物蛋白海绵体外生物学活性可作为常规检测方法;bFGF生物蛋白海绵常温储存2～4年稳定性良好。

抗菌肽protegrin的开发现状与作用机制研究

目的针对抗菌肽protegrin的开发现状、作用机制及研究方法等方面的文献进行了检索及总结,希望有助于同行在现有工作的基础上开发新型的抗菌肽。方法对国内外最新发表的抗菌肽protegrin的相关研究结果进行分析、整理和综合。结果抗菌肽protegrin是目前国际上研究比较深入的抗菌肽之一,而国内还没有相关的开发报道。结论抗菌肽protegrin是一种非常有应用价值和开发前途的新型抗菌物质。

牛气管抗菌肽cDNA的克隆与表达

目的:开发一种有效抑制动物细菌感染的重组抗菌肽。方法:根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP) mRNA序列设计引物,用RT-PCR从奶牛气管上皮细胞总RNA中扩增出214bp的bTAP cDNA,将其克隆入pUCm-T载体进行序列测定,将此cDNA分别克隆入真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-6p-1进行表达研究。结果:测序结果与已发表的bTAP序列有3个碱基差异,其中2个导致氨基酸替换;经微球菌溶解试验证明,注射在小鼠皮下的重组质粒pcDNA-tap能表达有活性的bTAP;抗体测定结果显示重组质粒pcDNA-tap经5次免疫后家兔产生的抗hTAP抗体效价达1:800;经IPTG诱导后,含重组质粒pGEX-tap大肠杆菌能表达预计大小的GST-bTAP融合蛋白,且能被兔抗bTAP识别。结论:本研究克隆的bTAP cDNA可用于表达研究及相关基因工程产品的开发。

类风湿关节炎基因治疗的研究进展

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是累及多关节、多系统的慢性自身免疫性疾病,在自身免疫性结缔组织病中患病率居首位。疾病可发展为关节僵直、畸形、致残而严重影响劳动力。RA的传统药物治疗多起效慢,长期使用副作用大,近年来兴起的生物治疗广泛应用于临床,但生物制剂昂贵、副作用大、需要反复注射且无靶器官特异性,而基因治疗则避免了这些缺点,选择性高,可以从分子水平针对发病机制进行治疗,为RA的治疗开辟了新领域。

重组SARS-C oV未知功能小蛋白X5表达、纯化及抗体制备

将SARS-CoV未知功能小蛋白X5的基因在大肠杆菌中进行诱导表达,获得以包涵体形式存在的重组X5蛋白。通过高浓度尿素变性溶解包涵体,亲和层析法纯化蛋白,然后对其进行尿素梯度透析复性,最终得到的蛋白纯度>95%,终产率93.3 mg.L-1。SDS-PAGE电泳和LC-ESI-MS/MS结果表明,该重组蛋白大小与理论相符,序列与GenBank中注册的X5蛋白序列一致,说明该蛋白为目的蛋白。利用纯化的X5蛋白制备得到多克隆抗体,ELISA检测抗体效价为1∶72900,说明纯化后的蛋白对兔有很强的免疫原性。X5多克隆抗体的成功制备,为将来鉴定X5蛋白的药理学活性奠定了基础。

伊尼奥小单孢菌2-脱氧蟹肌醇胺脱氢酶基因sisP的克隆与表达

目的:克隆西索米星生物合成基因——2-脱氧蟹肌胺(DOIA)脱氢酶基因。方法:以庆大霉素生物合成基因簇(AY524043)中的DOIA脱氢酶基因gntP作为参考模板设计引物,从伊尼奥小单孢菌(Micromonospora inyoensis)中,通过PCR方法扩增参与西索米星生物合成的DOIA脱氢酶基因,经测序鉴定、序列分析,并通过表达载体对该基因进行异源表达。结果:PCR扩增到一条长约1 035 bp的条带,包含一个开放阅读框长1 023 bp,推测其编码含340个氨基酸残基的蛋白质(相对分子质量约36×103),与已报道的DOIA脱氢酶同源性很高,该基因在IPTG诱导下,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)实现过量表达,表达产物的相对分子质量与预测值一致。结论:通过PCR技术从伊尼奥小单孢菌中克隆到参与西索米星生物合成基因——DOIA脱氢酶基因,命名为sisP,GenBank登录号为EU200975。

Affibody分子在生物技术和医学应用中的研究进展

Affibody分子,也被称为亲和体或者多肽适体探针,属于非抗体蛋白质的骨架结构。因其区别于一般抗体分子的结构特征,具有相对分子质量小、靶向性高、亲和力强,以及结构稳定、耐高温、可化学修饰等优势,因此Affibody的应用研究与发展迅速,已广泛应用于诊断和治疗等领域。对Affibody技术的最新进展,尤其是已经进行转化的研究进行重点综述。