简单异尖线虫D-天冬氨酸蛋白酶基因的克隆和表达

目的克隆简单异尖线虫Ⅲ期幼虫(L3)的D-天冬氨酸蛋白酶基因(AsAP)全长,研究其表达蛋白的特性。方法根据GenBank中简单异尖线虫D-天冬氨酸蛋白酶基因表达序列标签的部分信息,设计特异引物并用cDNA末端快速扩增技术得到AsAP全长序列,分析推导的蛋白序列特征,并预测其三级结构。用RT-PCR扩增简单异尖线虫L3的AsAP基因编码序列,产物用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,连入表达载体pET32а(+),转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测。结果简单异尖线虫L3的AsAP基因全长1 753 bp,编码453个氨基酸,与锡兰钩虫(Ancylostoma ceylanicum)的D-天冬氨酸蛋白酶相似性达65%。该蛋白具有两个保守的催化域,1个活性中心翼环,S2和S3亚位点各1个;具有由20个氨基酸组成的N端信号肽,构成疏水性强的跨膜域。不同浓度的IPTG(0.2～1.6 mmol/L)诱导对AsAP表达的影响较小,1.0 mmol/LIPTG诱导2 h后表达量达到最高水平。结论克隆并表达了简单异尖线虫的D-天冬氨酸蛋白酶。