棉花角斑病菌遗传驯化体系的建立

Xanthmonas citri subsp.malvacearum（Xcm）是棉花角斑病的病原,由于缺乏适合的遗传驯化体系,难于对其特定的基因进行研究,所以建立高效的基因缺失突变系统,是迫切需要解决的问题。采用去甲基化氮胞苷（5-AZA）驯化野生菌株Xcm 8号小种菌株V8和V8无细胞胞外物（CFEs）驯化重组质粒p K18mobsac B：：N1012及p K18mobsac B：：m762这2种驯化方法,以来自V8的hpa Xm N和hpa Xm为靶基因验证其有效性。结果表明,成功获得了△hpa Xm N和△hpa Xm突变体;虽然2种驯化方式都能获得转化子,但驯化菌株的电转化效率是驯化质粒的10~100倍。遗传驯化体系的建立消除了Xcm V8由于限制修饰系统引起的转化障碍,实现了特定基因的定点突变,为后续获得Xcm V8其他基因缺失突变体奠定了基础。

hpaXm和hpaXm-IP基因对棉花角斑病菌V8表型及HR的影响

试验前期通过构建相应敲除载体,采用电转化的方法,分别获得Xanthmonas.citri subsp.malvacearum(简称Xcm)菌株的hpaXm基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm和hpaXm-IP基因缺失突变菌株V8ΔhpaXm-IP。通过特殊生长平板及烟草接种试验表明,与V8菌株相比,突变菌株胞外多糖产量以及胞外纤维素酶、脂酶活性不变,V8ΔhpaXm菌株的胞外淀粉酶活性显著降低;3种菌株都不能产生胞外蛋白酶;突变菌株在烟草上形成的坏死斑面积变小。表明hpaXm和hpaXm-IP基因与病菌胞外淀粉酶活性及病菌激发烟草过敏反应的能力有关,与胞外多糖、纤维素酶、蛋白酶和脂酶产生无关。同时预示了hpaXm-IP可能具有牵引HpaXm蛋白泌出的能力,且HpaXm蛋白不是V8菌株中唯一激发烟草HR的活性物质,hpaXm及hpaXm-IP可能会影响V8菌株的致病性,但不是必然的。

棉花角斑病菌V8高效电转化条件的探索

对去甲基化氮胞苷(5-AZA)的最佳浓度以及影响棉花角斑病菌[Xanthmonas campestris pv.malvacearum(Xcm)]V8电转化效率的诸多因素进行逐一研究,以期获得高效的电转化条件。结果表明,选取100μmol/L的5-AZA驯化处于对数中期的V8制备感受态细胞;保证电压2.1 kV、50μg/mL质粒7μL、4℃预冷复苏培养基SOC、振荡复苏培养4~5 h时,V8的电转化效率高达5×10^2/μg DNA。