高产小粒咖啡叶绿体基因组密码子偏好性分析

【目的】分析高产小粒咖啡叶绿体基因组密码子的使用模式及其偏好性影响因素,确定合适的异源表达宿主,为探究咖啡的系统进化分析及基因功能验证特别是异源表达提供参考依据。【方法】从GenBank数据库检索下载高产小粒咖啡(MK353209)的完整叶绿体基因组序列,从中选择长度大于300 bp,以ATG开始,TAG、TAA和TGA结尾,内部不存在终止密码子及重复序列的51条编码区序列(CDS),运用EMBOSS在线网站和CodonW 1.4.2等分析软件,系统分析高产小粒咖啡基因组密码子使用特征及其影响因素,并与模式生物的密码子使用频率比较。【结果】高产小粒咖啡基因组的密码子第1位(GC1)、第2位(GC2)和第3位(GC3)的GC含量和3个位置的平均GC含量(GC)均未超过50.00%,30个RSCU>1.00的密码子中,以A/T结尾的密码子占比96.67%,以G/C结尾的密码子占比3.33%,表明高产小粒咖啡叶绿体基因组倾向于使用A/T结尾的密码子。有效密码子数(ENC)、密码子适应指数(CAI)、最优密码子使用频率(Fop)的平均值分别为46.97、0.167和0.353,暗示高产小粒咖啡叶绿体基因密码子偏好性较弱。20个高频密码子分别为GCT、TGT、GAT、GAA、TTT、GGA、CAT、ATT、AAA、TTA、AAT、CCT、CAA、AGA、TCT、ACT、GTA、GTT、TAT和TAA。中性绘图、ENC-plot、PR2-plot和对应分析结果显示,密码子的偏好性受到自然选择、突变等因素的共同影响,其中自然选择起决定作用。密码子使用频率比较结果显示,与拟南芥、烟草、大肠杆菌和酿酒酵母密码子使用频率相比,高产小粒咖啡分别有23.44%、15.63%、40.63%和15.63%的密码子使用模式差异较大。最终确定了21个最优密码子,其中57.14%的密码子以T结尾,38.10%的密码子以A结尾,4.76%的密码子以G结尾。【结论】高产小粒咖啡叶绿体基因组密码子的偏好性较弱,仅对A/T结尾的密码子呈偏好性,其受到自然选择、突变、基因表达水平、基因长度等多种因素的共同影响。酿酒酵母和烟草更适合作为高产小粒咖啡基因的异源表达受体系统。

中粒种咖啡叶片离体培养的研究

本文报道诱导中粒种咖啡叶片产生愈伤组织、胚状体以及再生小植株的方法。试验表明,诱导产生愈伤组织的关键激素是2,4-D和Kt,最有利于胚状体分化和小植株再生的培养基分别为MS+Kt2.0毫克/升+GA_30.5毫克/升+NAA0.2毫克/升和MS+GA_31.0毫克/升+IAA 0.5毫克/升。

秋水仙素诱导中粒种咖啡染色体加倍技术的研究

利用秋水仙素对中粒种咖啡直生枝幼芽进行加倍诱导。研究结果表明．秋水仙素的浓度在０．０５％～１．０％范围内加０．５％的二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）均获得良好的诱变效果．最高的变异率可达８３％。对变异材料进行截顶纯化、培养．获得７枝生长正常、稳定的主杆（Ｍ１代）。对所获得的Ｍ１代进行了多方面的倍性鉴定，结果表明，Ｍ１代是纯合的同源四倍体．即获得了人工诱导的同源四倍体，中粒种咖啡。同时获得了中粒种加倍诱导材料与正常二倍性中粒种自然杂交的杂种三倍体（其中２ｘ来自Ｍ１代父本．１ｘ来自二倍性中粒种母本）。

咖啡阿塔杂种的多倍体特征表现

通过对咖啡阿塔杂种的叶片厚度、叶形指数、单位面积气孔数及气孔直径进行观察研究发现，杂种四倍体与二倍性中粒种比较，叶片较厚，叶形较圆钝，单位面积气孔数少，气孔直径较大，表现了典型的同源多倍体特征．而杂种三倍体这四个性状的表现与二倍性中粒种无显著差异．

组织培养结合Co^(60)r射线诱变在咖啡育种中运用初探

M_0代胚状体在去分化培养基中能产生M_1代愈伤组织。愈伤组织形成的频率在15000r以内时基本不变,在15000r以上时开始下降,但下降速度缓慢,至35000r时仍保持66.7％。相比之下,愈伤组织的质量受剂量的影响较大,剂量在7000r以上时,所产生的愈伤组织质量明显劣化。M_1代愈伤组织被转到分化培养基上时能产生M_2代胚状体,同时也反常地产生了M_2代愈伤组织。M_0代胚状体在增殖培养基上存活率及增殖率,均在7000r以上时受到明显的影响。

小粒种咖啡叶片组织培养

本文报导了小粒种咖啡树(Coffea arabica)离体叶片脱分化和植侏的再生。利用组织培养方法无性繁殖咖啡良种是条可行的捷径。愈伤组织诱导率较高的培养基为MS+KT0.4毫克/升+2,4—D0.8毫克/升+蔗糖3％。用MS为基本培养基附加6-BA(0.3—5毫克/升)能达到胚状体的分化,其中以MS培养基附加6-BA0.5毫克/升分化率最高。胚状体在成苗培养基中培养,能获得具有根、茎、真叶的完整植株。小植株移入(石至)石基质中培养30天后可移到一般苗圃中。第一批咖啡试管苗于1988年11月定植于大田,成活率为95％。现已抽蕾开花。

小粒种咖啡与四倍体中粒种咖啡种间杂交与回交的试验结果

在肯尼亚西部的布什尔（Ｂｕｓｉａ）和西尔亚（Ｓｉａｙａ）两个地方，对第一个５年生长周期的２６个基因型咖啡品种进行了评价。在定植一年后，用小区平均值记录重要的产量组分包括茎粗（ｃｍ），株高（ｃｍ），主茎节间长度（ｃｍ）和最长一分枝的长度（ｃｍ）。在以后的４年里记录单株产量（千克／株）。变异分析结果表明这些基因型所有性状差异显著，暗示着这些性状遗传特性主要受基因调控。杂交种与卡杜拉回交表现出植株矮、节间短及第一分枝短的矮生特征。产量和茎粗的表现度受环境影响较大。由于这些基因型×环境效应是显著差异（Ｐ＝０．００１；和Ｐ＝０．０５）。在布什尔阿拉伯斯塔（Ａｒｕ－ｂｕｓｔａ）基因型品系３的产量最高，超过了３个对照品种（Ｃｏｎｇｕｓｔａ１６１Ｃｒａｍｅｒ，Ｃｏｎｇｅｎｓｉｓ２６３／１Ｃｒａｍｅｒ和中粒种。品系１１即阿拉伯斯塔与小粒种回交后代，在西尔亚产量最高．但在布什尔没有表现出高产的性能。产量稳定性分析结果显示，均方值差异不显著，表明回交代对边缘环境特别适应，能较好地缓冲环境变化。对试验结果进行了讨论。

杂种咖啡(Coffea canephora×Coffea arabica)花药培养研究初报

试验表明:诱导杂种咖啡花药产生愈伤组织频率最高的培养基是Ms+KT0.5毫克/升+2,4-D0.5毫克/升+5%蔗糖。愈伤织织在Ms+BA1.2毫克/升+NAA0.1-0.5毫克/升+3%蔗糖的培养基上,能产生胚状体;在Ms+BA0.5毫克/升+NAA0.1毫克/升+2.5%蔗糖的的培养基上,胚状体发育成苗的频率最高。经壮苗培养后,试管苗移值成活率可达66.7%。胚状体的细胞学鉴定表明存在着混倍现象。

咖啡种间杂种的不育性

本文研究了咖啡属六个二倍体种的六个种间杂种Ｆ１后代姊妹株之间生殖障碍的各种因素。提出花粉和柱头组织的原生质渗透浓度和杂种群体自花不孕等位基因遗传变异性的降低，就是可能的生殖障碍，因而也是这些杂种不育性的原因。

DNA标记技术在咖啡育种中的应用

咖啡树属茜草科、咖啡属,已鉴定的有100多种。商业性栽培的咖啡主要有两个品种:小粒种咖啡和中粒种咖啡。小粒种咖啡质量较好,其产量占全球咖啡产量的73％。中粒种咖啡被认为是抗病基因的重要来源,其抗病基因通过自然杂交或人工杂交方式转入到小粒种咖啡的基因库中。其它许多咖啡种也形成了一个有价值的基因贮存库,供不同育种目的用。但由于某种自然屏障、通过属间杂交将野生种的遗传性状转移到小粒栽培种上很难获得成功。