板栗MADS-box基因的分离及RNAi表达载体构建

以中国罗田板栗品种"玫瑰红"的幼叶和花为试材,采用EST数据库分析,结合RACE技术从板栗中分离到MADS基因的cDNA全长序列并构建了其RNA干扰载体,研究开花关键基因对板栗花芽分化的影响。结果表明:CmMADS基因全长为922bp的CmMADS的cDNA序列,该序列含有1个681bp的可读框,编码227个氨基酸序列。生物信息学预测CmMADS蛋白的分子质量为25.87kDa,理论等电点为6.27,N端具有M盒保守序列,其二级结构主要由α?螺旋和无规则卷曲组成。蛋白质同源分析表明,CmMADS含有M盒和K盒2个特征性序列区域。同源建模分析显示CmMADS序列与苹果MADS蛋白的三维结构及活性位点高度相似。系统进化分析表明,板栗MADS蛋白归属植物进化分支,且与太行花的MADS蛋白归为一支。将CmMADS基因2段相同长度(283bp)的反向互补片段RMADS和FMADS连入载体pBluescript SK plus,构成中间载体pBluescript SK plus-FR。用BanHI和KpnI同时酶切中间载体pBluescript SK plus-FR和植物表达载体pCl301-ubi,回收pBluescript SK plus-FR的酶切小片段,连入pC1301-ubi大片段中,构成植物表达载体pC1301-ubi-CmMADS-RNAi。下一步拟用构建好的RNA干扰载体转化农杆菌并由其介导将重组质粒转入烟草,为深入研究该干扰载体的功能及CmMADS基因的功能提供参考。

板栗颗粒型淀粉结合酶基因cDNA的克隆与生物信息学分析

以板栗为试材,采用RT-PCR技术,克隆了颗粒性淀粉结合酶(GBSS)的基因,并进行了生物信息学分析。结果表明:从板栗果实中分离了GBSS基因cDNA全长,命名为Cgbss,登录GenBank号为KU162945。该基因全长2 085bp,编码区全长为1 836bp,编码611个氨基酸。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白质等电点和分子量为8.36和67.580 9kDa,含有典型的GT1家族的糖基转移酶蛋白功能域。序列分析表明,该基因与所报道的植物GBSS I的基因有85%的同源性。

雄性不育板栗种质杂交结实特性研究

对板栗雄花败育种质及其授粉结实特性进行了研究,分析了不同父本对雄性不育种质结实的影响,探讨了以雄性不育种质为母本,不同父本杂交,板栗坚果性状方面的变异情况,以揭示板栗雄性不育种质的育种价值,奠定板栗雄性不育育种及其理论研究的生物学基础。结果表明:雄性不育种质具有较强的授粉结实能力,坐苞率和结实率均在90%以上,空苞率4%,每苞含坚果2.6粒,坚果高宽厚表现稳定,单粒重变异幅度稍大,变异系数达到16.10%;父本不同,雄性不育种质结实特性存在差异,"燕平"、"河北短丰"与雄性不育种质亲和力最强,结实率和空苞率分别为95.35%、74.78%和4.65%、2.61%;雄性不育种质具有较强的接收远缘花粉的能力,与"锥栗"杂交结实率达到44%,远高于"怀黄";杂交后代中,各组合间变异稳定,坚果平均单粒重8.50～9.50g,且坚果高度、宽度、厚度以及单粒重等性状在各杂交组合间的变异系数均在5%以下;各组合内部,坚果单粒重变异较大,变异系数为8.64%～16.10%,坚果厚度变异次之,坚果高度和宽度变异较小,最为稳定。

云南“永丰1号”与引种“燕龙”板栗雄配子体发育

以引种的"燕龙"板栗和云南省永仁县本地"永丰1号"品种为试材,采用环氧树脂半薄切片法对二者的雄配子体发育进行了系统的比较研究,揭示了其生殖学进程和特点。结果表明:本地"永丰1号"板栗雄配子体发育早期较慢,后期较快,引种"燕龙"板栗恰恰相反;而且"永丰1号"板栗雄配子体发育比"燕龙"提前约9d。二者雄配子体发育从开始到结束整体用时相近,约32d;花药有4个花粉囊,两瓣、成对;绒毡层类型为腺质绒毡层;花药壁发育类型为基本型;花粉粒为长球型。

板栗IFRs启动子分离及表达载体构建

以湖北省罗田板栗品种乌壳栗为试材,采用染色体步移的方法获得了板栗IFR启动子序列,研究了板栗黄酮代谢途径中关键基因IFR的启动子顺式作用原件及可能对雄花黄酮类物质合成的影响,并构建pCAMBIA1304融合载体。以期揭示板栗雄花黄酮代谢合成途径,IFRs启动子上游所包含的顺式元件对环境和栽培措施的响应及对板栗雄花发育的影响。结果表明:长度为1 688bp的板栗IFRs启动子序列包含多种类型的顺式作用元件,包括光响应元件GT-1motif、ASF-1motif等;与赤霉素,脱落酸、乙烯等相关的激素响应元件,如WRKY motif(赤霉素信号途径转录因子)、GCC-box(乙烯应答元件)以及Dc3(脱落酸响应元件)等;逆境胁迫相关的功能元件,如与抗损伤相关的ERF3、抗病相关的TGTCA-box等。以此推测,CmIFR基因的表达可能会受到以上光、激素、各种生物或者非生物胁迫等因素的影响。为了后期进一步研究启动子的功能,按照启动子功能区域,设计了CmIFR启动子不同长度的6个功能片段,并将这些片段替换pCAMBIA1304中的35S启动子,成功构建了由CmIFRPs启动子不同区域驱动的gus基因的植物表达载体pCAMBIA1304+CmIFRPs。

板栗针叶小爪螨体内Wolbachia的wsp基因序列测定与分析

以板栗针叶小爪螨为试虫,采用PCR扩增法,应用Wolbachia的wsp基因特异引物对我国部分板栗产区(北京密云南达峪村、山东泰安赵峪村与山东临沂柳条峪村)板栗园针叶小爪螨进行了检测,以期为通过分子生物学手段检疫鉴定针叶小爪螨提供参考依据。结果表明:在北京密云南达峪村与山东泰安赵峪村板栗园针叶小爪螨体内扩增出593bp Wolbachia的wsp基因;在山东临沂柳条峪村板栗园针叶小爪螨体内未检测到Wolbachia特征基因片段。利用所测序列和其它已发表的序列建立系统树,发现针叶小爪螨体内Wolbachia属于B大组的Epo小组。