抗菌肽Abaecin的表达及生物活性的研究

在枯草芽孢杆菌中表达抗菌肽Abaecin,并鉴定表达产物的生物学活性,以判定其能否开发为口服药物和饲料添加剂。通过Western blot方法检测目的基因表达情况;采用琼脂扩散法检测表达产物的生物活性。结果表明:抗菌肽Abaecin在枯草芽孢杆菌中成功表达,并有效地分泌至细胞外。体外抑菌实验结果表明,表达产物Abaecin对革兰氏阴性菌有抑菌活性,并且在不同温度37～100℃、pH2～9和酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K)的条件下,仍能保持抗菌活性,证实表达产物可以抵抗动物消化系统的降解。枯草芽孢杆菌简便快捷地表达了抗菌肽Abaecin,并且表达产物有开发为口服药物和饲料添加剂的前景。

抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达的研究

为了利用组成型表达方法在Pichia pastoris SMD1168中表达抗菌肽Cecropin AD,利用化学方法合成编码抗菌肽Cecropin AD的基因片段SH,将基因片段SH插入到载体pGAPZa-A中命名为pGAPZa-ASH,将pGAPZa-ASH电转至Pichia pastoris SMD1168中,Zecion抗性筛选阳性重组子。用Tricine-SDS-PAGE分析表达状况,琼脂扩散法检测蛋白的抑菌活性。结果表明:在3.0ku处有目的条带,并且表达产物抗菌肽Cecropin AD有生物活性。研究利用组成型表达方法在毕赤酵母菌株成功表达了抗菌肽Cecropin AD。组成型表达方法在本研究中成功的应用,为以后的实验研究奠定了理论基础。

液相色谱-串联质谱测定饲料中7种硝基咪唑类药物

采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定了饲料中甲硝唑（MNZ）、地美硝唑（DMZ）、洛硝唑（RNZ）、替硝唑（TNZ）、奥硝唑（ONZ）、异丙硝唑（IPZ）和塞克硝唑（SCZ）等7种硝基咪唑类药物。样品用乙酸乙酯提取,正己烷-磷酸溶液反萃取,MCX柱净化,以0.1%乙酸水溶液和乙腈作流动相进行梯度洗脱,电喷雾电离源正离子（ESI＋）多反应监测（MRM）模式下检测。方法的检测限和定量限分别为0.03 mg/kg和0.1 mg/kg。添加浓度为0.1、1 mg/kg和10 mg/kg时的平均回收率为72.9%~98.8%,变异系数为4.9%~12.1%。

液相色谱-串联质谱法同时测定生鲜乳中四环素类和β-内酰胺类药物残留

试验旨在建立了反相液相色谱一串联质谱法同时测定生鲜乳中四环素类和β-内酰胺类药物残留的方法，可用于生鲜乳中四环素、金霉素、土霉素和强力霉素等4种四环素类和阿莫西林、苄青霉素、氨苄青霉素、苯唑西林、氯唑西林、头孢氨苄、头孢噻呋等7种口一内酰胺类药物残留的同时测定。结果表明：11种化合物溶液浓度在1-80μg／L有较好的线性关系，γ〉0．99，方法的检出限在0．1—1μg／L。苄青霉素的回收率较低，只有60％左右，其他化合物的回收率均在81％～119％、相对标准偏差在1．23％～14．80％。方法的灵敏度较高，且简便、快速，可以较好的解决目标物极性差别大及牛奶中蛋白质对检测结果的干扰等问题，能够很好的满足生鲜乳中抗生素残留检测的需要。

产抑菌蛋白的丁酸梭菌的筛选和鉴定及体外益生功能研究

试验旨在筛选产高效抑菌蛋白的丁酸梭菌,并研究其体外生物学特性,为其在动物生产中的应用奠定基础。采用厌氧培养法进行菌种分离,孔穴琼脂扩散法进行抑菌活性筛选,并通过形态学、生理生化特性和16S r DNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定。选取丁酸梭菌ZJU-1进行体外抗逆性和益生功能研究,采用试剂盒进行酶活测定,顶空-气相色谱发测定挥发性脂肪酸。结果表明:从盲肠内容物中分离到6株丁酸梭菌,其中3株菌种对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌ATCC25923均具有明显抑制作用。目标菌株ZJU-F1经鉴定结果为丁酸梭菌。丁酸梭菌ZJU-F1具有较好人工胃液、人工肠液、胆盐和抗生素耐受性;分泌淀粉酶和蛋白酶,活性分别达2 515.43 U/m L和93.72 U/m L;并具有分泌挥发性脂肪酸的功能,其中乙酸和丁酸的分泌量分别达2.29 g/L和1.87g/L。本试验获得的丁酸梭菌ZJU-F1具有较强的抗逆性和益生功能,作为潜在的抗生素替代物具有巨大的开发利用价值.

应用发光细菌法检测饲用抗生素单一及联合毒性的研究

以HgCl2为毒性参照,以等毒性配比法研究了饲用盐酸金霉素、吉他霉素、盐霉素和黄霉素对发光细菌的单一及联合毒性。结果表明：盐酸金霉素、吉他霉素、盐霉素、黄霉素对明亮发光杆菌的急性毒性EC50分别为9.21、146.13、4.24 mg/L和134.68 mg/L,发光细菌的相对发光强度（RLU）随着抗生素浓度的提高而降低,并分别在2~16、25~200、1~8 mg/L和25~200 mg/L范围内呈良好线性关系;多元饲用抗生素对发光细菌具有联合毒性的作用,吉他霉素与盐酸金霉素、盐霉素和黄霉素3种抗生素的二元组合对发光细菌的联合毒性表现为较强的协同作用,而盐酸金霉素、盐霉素和黄霉素两两分别组合对发光细菌的联合毒性表现为拮抗作用;三元及四元抗生素混合体系对发光细菌的联合毒性均表现为拮抗作用。

多壁碳纳米管分散固相萃取结合LC-MS/MS测定饲料中11种β-受体激动剂

本研究建立了采用多壁碳纳米管(MWCNTs)为吸附剂的分散固相萃取(dSPE)净化、液相色谱串联质谱测定饲料中11种β-受体激动剂(克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、氯丙那林、妥布特罗、西马特罗、特布他林、马布特罗、班布特罗和喷布特罗)的方法。饲料样品经甲酸水溶液提取后,调节pH值至10,加入50 mgMWCNTs进行分散固相萃取,被吸附的化合物经1.0%甲酸水甲醇(91)洗脱,洗脱液过滤膜后进行LC-MS/MS分析。采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱分离,以0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱,电喷雾正电子(ESI+)模式电离,多反应监测(MRM)模式监测,内标法校准进行定量。结果表明:11种β-受体激动剂在0.1～20μg/L浓度范围内呈良好的线性,线性相关系数均大于0.997,猪配合饲料样品中最低定量限为0.05～0.48μg/kg。猪配合饲料中添加0.5～500μg/kgβ-受体激动剂的回收率在89.6%～112.9%,相对标准偏差RSD均小于15%。

一株肠源枯草芽孢杆菌的生长、抗逆和产酶特性分析

本试验分析了一株肠源枯草芽孢杆菌生长特性,耐酸、胆盐、高温和重金属性能以及产蛋白酶、淀粉酶的能力。结果表明:菌株最大生长浓度出现在22 h左右。菌株在pH 3.0营养肉汤培养基中培养3 h,存活率为58.6%,培养时间延长至6 h,存活率仍能达到47.5%。在胆盐浓度为0.3%,培养4 h后枯草芽孢杆菌存活率为65.5%,8 h后的存活率仍能达到40.4%。在90℃下,处理10 min成活率为61.8%,处理20 min后仍能达到33.3%。当Cu离子和Zn离子浓度为500 mg/L时,菌株生长量相当于对照的107.6%和86.7%。菌株培养48 h后上清液的淀粉酶活性为1.89 U,蛋白酶活性达到655.2 U。结果表明,本枯草芽孢杆菌具备较好的生长与抗逆特性和较高的酶活力,具备作为益生菌的潜在特质。

抗菌肽与常用抗菌素对罗非鱼生长性能影响的比较研究

试验旨在研究黄霉素、抗菌肽、喹烯酮和喹乙醇等4种促生长剂对罗非鱼生长性能的影响。选用800尾体重为(10.3±1.4)g的健康罗非鱼鱼种分为4个处理,每个处理5个重复,每个重复40尾。不同处理组基础饲料一致,饲料中分别添加10 mg/kg黄霉素、50 mg/kg喹乙醇、50 mg/kg喹烯酮和100 mg/kg抗菌肽(天蚕素),试验期为42 d。结果表明:试验全期不同处理组罗非鱼成活率都达到100%,饵料系数、特定生长率和肥满度均无显著差异(P>0.05)。试验前5周不同处理组罗非鱼增重无显著差异(P>0.05),第6周抗菌肽组增重显著高于喹乙醇组和喹烯酮组(P<0.05),全期增重抗菌肽组极显著高于喹烯酮组(P<0.01),显著高于喹乙醇组(P<0.05),黄霉素组的增重显著高于喹烯酮组(P<0.05),喹烯酮组和喹乙醇组无显著差异(P>0.05),黄霉素组和抗菌肽组无显著差异(P>0.05)。试验证明,抗菌肽和黄霉素在促进罗非鱼生长方面优于喹乙醇和喹烯酮。

12株芽孢杆菌体外抗氧化特性比较研究

为比较12株芽孢杆菌(B1到B12)的抗氧化性能,分别测定其培养上清和无细胞提取物中的抗氧化指标,包括1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除率、羟自由基清除率、还原性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。结果表明:所有菌株均具有上述抗氧活性,其中在无细胞提取物中DPPH清除率最高的菌株为B7,在培养上清中GSH-Px和SOD酶活性最大的菌株分别为B4和B11。

磺胺二甲嘧啶药物残留ELISA检测试剂盒的研制及初步应用

本试验旨在采用重氮化法合成的免疫抗原通过免疫BALB/c小鼠进行融合,获得高特异、高灵敏度的单克隆抗体。在建立磺胺二甲嘧啶单克隆抗体(SM2 mAb)杂交瘤细胞株和阻断ELISA的基础上,初步研制出一种一步法检测磺胺二甲嘧啶(SM2)的ELISA快速检测试剂盒(SM2-Kit)。结果表明:SM2-Kit检测范围为0.5～40.5μg/L,检测时间为30 min,IC50为1.4μg/L,最低检测限达0.1μg/L。经大量现场试验,猪肉组织最低检测限为1μg/kg,猪饲料最低检测限为1μg/kg,猪尿最低检测限为1.8μg/L,牛奶最低检测限为1.5μg/L,测试的回收率平均在70%～110%。

芍药苷对肺微血管内皮细胞内一氧化氮水平及eNOS表达的影响

为探讨中药芍药主要有效成分芍药苷扩张微血管以及抗炎的机理,试验研究了芍药苷对体外培养肺微血管内皮细胞内一氧化氮(NO)浓度及一氧化氮合成酶(eNOS)表达的影响。试验采用植块法培养大鼠肺微血管内皮细胞,培养细胞经NO分子探针DAF-FM diacetate负载后,利用Ratio/FRET比率测量系统实时检测芍药苷处理前后细胞内NO浓度的变化,并采用ELISA检测不同浓度的芍药苷对肺微血管内皮细胞表达eNOS的影响。结果表明:10μg/mL芍药苷刺激细胞1 min后引起细胞内NO浓度增加;同等剂量的芍药苷作用4 h内,肺微血管内皮细胞表达eNOS升高。说明芍药苷可促进内皮源性NO的产生与释放,介导内皮依赖性舒张反应,减轻炎症损伤。