Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离鉴定及其高免卵黄抗体的制备

为了确定山东某养殖场疑似患有鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)病死鸭的病原,并针对该病原制备高效且安全的卵黄抗体(antibody of yolk,IgY),试验无菌采集病死鸭肝脏组织样品,通过细菌检测、病毒的分离与增殖、特异性基因的RT-PCR鉴定与序列分析及动物回归试验确定病原,采用Reed-Muench法计算半数致死量(LD_(50)),并针对病原制备油乳剂灭活苗,按照免疫程序将其免疫产蛋鸡,收集免疫鸡的鸡蛋,采用生理盐水法提取IgY,测定IgY的中和效价,最后进行动物被动免疫试验,探究IgY对攻毒雏鸭的免疫保护作用。结果表明:将病死鸭肝脏组织划线接种于营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基,培养后均无细菌生长,病死鸭肝脏组织和增殖尿囊液均扩增出Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)特异性基因片段,目的基因与GenBank中的9株DHV-Ⅰ参考株的相应基因序列的相似性为99.1%~99.2%,确定分离出1株DHV-Ⅰ,命名为SD,分离株SD对9日龄鸭胚的LD_(50)为1×10^(-8.25)/0.2 mL。将分离株重新接种健康雏鸭,出现DVH典型的症状,死亡率为100%,提取死亡雏鸭肝脏组织中的病毒RNA,经RT-PCR后能扩增出目的条带,测序结果与分离株SD一致。制备的油乳剂灭活苗稳定性良好,30 min内不分层,雏鸭注射后14 d内生长无异常。制备的IgY抗体中和效价为1∶256,注射IgY后第1~5天攻毒,10 d后的保护率为87.5%~100%,注射IgY后第7天攻毒,10 d后的保护率为75%。说明从发病鸭群肝脏组织中分离出1株高致病性的DHV-Ⅰ,制备的油乳剂灭活苗免疫蛋鸡后获得高效价IgY,对攻毒雏鸭具有很好的免疫保护作用。