不同源1型副粘病毒分离株部分生物学特性比较

从血凝谱与血凝效价、对SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)、致死鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)的测定及对雏禽的致病性等方面比较不同源1型副粘病毒的生物学特性,结果5株不同源1型副粘病毒(2株鸭源1型副粘病毒、1株企鹅源1型副粘病毒、1株猪源1型副粘病毒及1株鸡源新城疫病毒参考强毒)对16种不同动物和O型人的红细胞的血凝谱不同,其血凝效价也存在差异,为24-211;对SPF鸡胚的ELD50为10-1-10-9.5,MDT为51.0-113.4 h,ICPI为0-1.83,对海兰公雏的致病性分别为62.5%、8.3%、54.2%、12.5%、95.8%,而对雏番鸭的致病性分别为60.0%、0、53.3%、0、86.7%。

雏番鸭感染禽副黏病毒1型的分离鉴定

从呼吸困难、肠道粘膜出血、胰腺大量白色坏死点为特征的7日龄病死雏番鸭的肝脏中分离到1株病毒。经电镜观察发现该病毒为多形性有囊膜病毒,表面有呈辐射状分布的纤突;血清学鉴定表明,能在4℃下凝集鸡和鸽红细胞,其血凝活性能被NDV标准阳性血清特异性抑制。该病毒对10日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50)和平均致死时间(MDT)分别为10-8.5/0.1 mL和63.2 h,对番鸭胚成纤维细胞的TC ID50为10-6.32/0.1 mL。经静脉和腿部肌肉两种途径分别接种10日龄雏番鸭和非免疫雏鸡,均可引起发病死亡,并从死亡雏番鸭和雏鸡中可回收到原攻击病毒。依据以上结果表明所分离病毒为中等偏强毒力的禽副黏病毒1型。

喹乙醇中毒对崇仁麻鸡抗氧化功能影响的研究

将200羽30日龄崇仁麻鸡随机分为5组:第Ⅰ组(对照组),喂基础日粮;第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组在饲喂基础日粮的基础上分别添加喹乙醇30,60,120,240 mg/kg饲料,通过人工复制喹乙醇中毒病例,对崇仁麻鸡喹乙醇中毒进行抗氧化功能影响的研究。结果:中毒组鸡血清中的SOD、GSH-Px的活性降低和GSH的含量下降,MDA和活性氧的含量升高,说明自由基与喹乙醇中毒的发生、发展有密切关系。

减蛋综合症病毒六邻体蛋白基因的克隆与序列分析

设计了1对特异性引物,应用降落PCR法对减蛋综合症病毒(EDSV)六邻体蛋白基因进行了扩增。将扩增产物克隆至pMD18-T载体中,经酶切和PCR鉴定后,初步证明了目的片段的正确性。进一步经核苷酸序列测定表明,所扩增的基因片段长度为2.74kb,共编码910个氨基酸,与由EDSV弱毒株(AA-2)全基因组的Hind酶切片段测序所得到的六邻体结构基因推测的氨基酸序列相比,有11处氨基酸发生了变异。

禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究

为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的多重RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性。

环洞庭湖区活禽批发市场和水禽场H6亚型禽流感监测

为了解环洞庭湖区活禽批发市场和水禽场H6亚型禽流感病毒的分布和流行情况,分别于2009—2011年对环洞庭湖地区活禽批发市场、2011—2013年对水禽场的H6亚型禽流感进行了系统监测。对在活禽批发市场上采集的拭子样品先由尿囊腔接种SPF鸡胚,然后用血凝试验(HA)测定所收集的尿囊液,对HA测定有滴度的再进行血凝抑制试验(HI),并与RT–PCT方法相结合鉴定病毒的亚型。检测结果显示:在环洞庭湖区的5个活禽批发市场上都分离到H6亚型禽流感,并且在鸡、鸭、鹅拭子中都分离到该病毒,总的分离率为6.49%;水禽场H6亚型禽流感病毒群体阳性率达3.6%,拭子的H6亚型病毒分离率为0.29%,活禽批发市场鸭拭子H6亚型禽流感病毒分离率为9.58%,表明市场环节水禽H6亚型禽流感的隐性带毒率比养殖环节高,在一定程度上说明禽流感在活禽批发市场存在水平传播的风险。

一步法复合RT-PCR鉴别ND强毒与AI病毒的研究

根据新城疫病毒(NDV)融合蛋白和禽流感病毒(AIV)核蛋白的核酸序列设计2对引物,对NDV和AIV的特异扩增片段分别为156 bp和219 bp,建立了同时检测强毒力NDV和AIV核酸的一步法复合RT-PCR。试验中未能检出弱毒力NDV,IBV,IBDV,REV,REOV及SPF鸡肌肉组织的RNA,从不同年代分离的16个NDV强毒株全为阳性而NDV弱毒株全为阴性。经验证,复合引物与单一引物的扩增效率一致,能够检出NDV和H5亚型AIV的最低病毒量分别为103.7EID50和103.9EID50。试验结果表明,此次建立的一步法复合RT-PCR特异、敏感,适用于强毒力NDV和AIV感染的快速鉴别。

小鹅瘟病毒YZ-0703株的分离鉴定及生物学特性研究

从扬州郊区某鹅场死亡的、具有小鹅瘟典型病变的雏鹅肝、脾、肠病料组织中分离到一株病毒。经过试验鉴定,该毒株能与小鹅瘟阳性血清发生沉淀反应,通过电镜可以观察到典型的细小病毒样粒子;人工感染雏鹅,可引起发病和死亡,并与自然病例有相似的临床症状和病理变化。该毒株的鹅胚半数致死量(ELD50)为106.16 0.2 mL,最小致死量病毒致死鹅胚的平均时间(MDT)为93.6 h;结果表明,该野外分离病毒为小鹅瘟强毒株,命名为YZ-0703株。

禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增

PCR技术是分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之一。然而,找到一对合适的核苷酸片段作为引物,使其有效地扩增模板DNA序列,决定着PCR的成败。在GENEBANK中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析它们的同源性,利用Primer Premier5.0软件进行引物设计。多重RT-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳结果显示引物设计成功。

荧光定量RT-PCR鉴别IBDV超强毒株与经典疫苗毒株

鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)超强毒株的出现给该病的防控带来了新的困难,有效鉴别IBDV超强毒株对IBD的防控有着积极意义。根据IBDV VP4基因的保守序列,设计了一对通用引物RPa/RPb,特异性扩增IBDV VP4基因720bp的目的片段。根据超强毒株和经典毒株VP4基因序列的差异,分别合成了FAM标记的超强毒荧光探针和JOE标记的经典毒荧光探针,建立了实时荧光RT-PCR鉴别IBDV超强毒株与经典疫苗毒株的方法。检测超强毒和经典毒的敏感性分别可达420和320个拷贝数。建立的实时荧光RT-PCR方法敏感性高、特异性强,可用于临床样品中IBDV超强毒和经典毒的鉴别诊断。

免疫金探针快速检测禽流感病毒研究

本试验将兔抗禽流感H5、H9亚型病毒抗体纯化后,分别与制备的胶体金研制成免疫金探针,用改良的渗滤法安全快速地检测被检材料中禽流感H5、H9亚型病毒。试验表明,该法对禽流感H5、H9亚型病毒的检测灵敏度分别为1.62μg.ml-1和1.25μg.ml-1。对阳性样品进行重复性试验3次检测结果完全相同。阻断试验和交叉试验表明该法有很高的特异性。对禽流感H9亚型病毒人工发病鸡的病毒检测阳性率为70%,与临床疑似病例禽流感病毒分离的阳性符合率为100%。

传染性法氏囊新城疫病毒二联疫苗株接种后气管黏膜损伤研究

为了研究传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒(rlasota-vp2)二联疫苗株的免疫机制,用rlasota-vp2免疫2日龄SPF雏鸡,接种后分别在接种后的1,3,5,10,15,18 d取气管,进行光镜、电镜观察,利用免疫组化染色方法检测病毒在气管内的分布;光镜观察发现,接种后第3 d黏膜下层水肿,淋巴细胞、巨噬细胞浸润,黏膜上皮形成空泡状,表层有数层不成熟的细胞组成;接种后第10 d,腺体腔闭塞。免疫组化染色(IHC)气管固有层细胞呈阳性反应,棕色颗粒出现在胞浆中。电镜观察发现接种rlasota-vp2后第3 d纤毛细胞有脱纤毛现象。接种第3 d杯状细胞破碎,黏液成分增多,黏膜下层的纤维裸露到表面;接种后第10 d,可以看到纤毛细胞纤毛上有球形粒子,杯状细胞、基细胞大量增生;接种后第18 d,纤毛细胞脱纤毛区域进一步增大。这说明气管黏膜的损伤是机体重要的防御机制和免疫机制的表现。

鸡传染性支气管炎弱毒苗的毒力返强检测

将鸡传染性支气管炎疫苗毒接种10日龄鸡胚,并传至12代,观察鸡胚病变,于72 h收集尿囊液进行负染电镜观察和血凝试验.透射电镜观察到典型的冠状病毒颗粒,致鸡胚的典型病变作用和血凝活性随培养代次的增加显著增强.结果表明,该弱毒苗病毒毒力返强,存在安全隐患.

鸡体抗病毒蛋白基因荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用

为建立检测鸡干扰素诱生的3种抗病毒蛋白(IFIT5、PKR和OASL)基因表达水平的荧光定量PCR方法,并将其应用于实践,本研究设计和筛选了3个基因的特异性扩增引物,制备了各基因的质粒标准品,绘制了荧光定量PCR的标准曲线,并检测了该方法的灵敏度、重复性和特异性。结果表明所建立的方法敏感度高、特异性强、检测线性范围广、重复性好,应用该方法检测了新城疫病毒感染SPF鸡胚后相关基因的表达情况,发现在病毒感染后IFIT5、PKR与OASL基因的表达水平均迅速提高。

新型鹅星状病毒AHQJ18株的分离鉴定

星状病毒于1975年在肠炎患儿的粪便样品中被首次发现[1],随着时间的推移和检测技术的不断进步,星状病毒的种类、宿主及流行范围相继扩大。目前,星状病毒在全世界不同地区不同种类哺乳动物中的感染非常普遍,并且还能感染各种禽类[2]。星状病毒主要引起感染哺乳动物的肠道疾病,对于感染的禽类,除肠道炎症外,还可引发鸡肾脏疾病,雏鸭的病毒性肝炎等[3-5]。星状病毒为无囊膜的单股正链RNA病毒,基因组变异较大,全长约6.1~7.9 kb,包括5′UTR,3个开放性阅读框(ORF1a、ORF1b和ORF2),3′UTR及多聚腺苷酸(PolyA)尾,不同种星状病毒之间存在基因重组现象。星状病毒基因组的高度变异使其对环境和宿主具有很强的适应能力,甚至可跨种传播,是威胁人类健康和动物养殖业的重要传染病原之一。

新城疫病毒出芽机制的研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus,virus,NDV)是引起禽类急性、高度接触性传染病-新城疫(Newcastle disease,ND)的病原,给养禽业造成了严重经济损失,虽然有疫苗可用于该病的预防,但由于对病原的致病机理、免疫机理了解不充分,一直没能从根本上控制该病。近些年来,VLPs(Virus-like Particles,VLPs)技术在病毒的组装和出芽机制的研究以及某些传染病的疫苗开发上应用广泛,以VLPs技术阐述了NDV出芽的机制。

鸡肾型IBV分离鉴定及S1基因序列分析

2008年从河南省某肉用鸡场疑似感染肾型IB的病鸡中分离到1株IBV,对该分离毒株进行鸡胚矮小化试验、动物回归试验和血清学鉴定,试验结果表明分离株HeNan10/08为肾型IBV。采用RT-PCR技术扩增分离株的S1基因,并进行克隆和序列分析。结果表明,分离株HeNan10/08与B J株S1基因的同源性最高,核苷酸序列同源性为99.9%,推导氨基酸序列同源性为100.0%;与M41的同源性最低,核苷酸序列为78.7%,推导氨基酸序列同源性为79.0%。

禽脑脊髓炎冻干活疫苗安全性、最小免疫剂量及免疫效力试验

检测了4批自制禽脑脊髓炎冻干活疫苗的安全性和最小免疫剂量,并对疫苗进行了病毒含量测定和攻毒保护试验。结果表明,鸡接种疫苗后精神、食欲及发育均正常,疫苗安全性良好;接种病毒剂量为500 E ID50时,可使免疫鸡产生可靠的免疫力,抵抗AEV VR株强毒的攻击,降低鸡群发病率,所以该疫苗的最小免疫剂量≤500 E ID50/羽。4批疫苗病毒含量均大于103.5E ID50/羽份,攻毒后保护率均在87.5%以上。

基因芯片在禽流感病毒检测中的应用研究进展

禽流感病毒是一种引起全球人和动物呼吸道疾病的重要病原,早期快速检测禽流感病毒是预防和控制禽流感的前提条件。本文对基因芯片在禽流感病毒检测以及禽流感病毒和其他病毒同时检测中的最新应用进行综述,希望能为禽流感的早期快速检测和防治提供一定的参考。

新城疫病毒Roakin株HN基因的克隆及真核表达载体的构建

克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体。应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析。然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因—二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体。RT-PCR扩增的NDVRoakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D。成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体。