重组产气荚膜梭菌β毒素突变体的表达与免疫保护性分析

旨在获得产气荚膜梭菌β毒素(CPB)的重组突变体,并评价其毒力及免疫保护性。对已知的产气荚膜梭菌CPB编码基因进行优化设计,同时引入4个氨基酸突变位点,分别是第212位的精氨酸突变为谷氨酸,第268位的亮氨酸突变为甘氨酸,266位的酪氨酸和275位的色氨酸突变为丙氨酸。此外,在该基因5′端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端的编码序列,经人工合成获得重组基因片段(GTF_(N)CPB_(m4))。将GTF_(N)CPB_(m4)克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTF_(N)CPB_(m4)。利用Western blot方法检测rTF_(N)CPB_(m4)与C型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性,并检测rTF_(N)CPB_(m4)对小鼠的毒力。随后,以rTF_(N)CPB_(m4)免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。结果表明,rTF_(N)CPB_(m4)主要以包涵体的形式表达且能与C型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。小鼠安全性试验显示,50μg的rTF_(N)CPB_(m4)对小鼠仍无致死性;免疫rTF_(N)CPB_(m4)后,每毫升家兔二免抗血清可中和10~20个小鼠最小致死量(MLD)的C型产气荚膜梭菌毒素;1个家兔MLD的C型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rTF_(N)CPB_(m4)在丧失毒力的同时保留了良好的免疫原性,从而为C型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的数据。