水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达

根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列分别设计合成两对引物,用PCR方法扩增ADV国内分离株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中。经酶切、PCR扩增和测序分析证实其已正确插入到表达载体中,且阅读框是正确的,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb。阳性重组质粒转化宿主菌TB1,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析。结果表明两段蛋白均获得了表达,表达产物的分子质量分别约为63、65kD,与理论推测的分子质量一致;并在终浓度为1mmol/L的IPTG诱导下,4h时其表达量达到高峰;Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别,具有一定的抗原性。

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21(DE3)在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。

犬细小病毒VP2基因的克隆表达与免疫印迹分析

根据基因库已发表犬细小病毒序列设计合成了VP2基因的1对特异引物,以细小病毒感染的犬粪样品中提取的总DNA为模板,进行PCR扩增。把扩增产物克隆至pMD18-T载体进行测序、鉴定。将克隆的VP2基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,再将构建成功的原核表达质粒载体pGEX-4T-2-VP2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,进行鉴定、测序、表达。结果表明,克隆的VP2基因片段全长1 755 bp,与13个VP2基因序列的同源性为98.4%～99.8%。系统进化树分析表明,所克隆的VP2 CSN830611序列同日本株(AB054222)、意大利株(AF306445)的进化途径一致。Western-blotting分析显示,表达产物为90 kD的融合蛋白,可被犬细小病毒阳性血清所识别,具有良好的反应原性。

猪圆环病毒Ⅱ型新疆分离株全基因组及ORF2基因的克隆与测序

根据GenBank中已发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了2对特异性引物。将PCV2新疆分离株(PCV2-XJ)用PK15细胞培养数代,从细胞培养物中提取病毒总DNA,并取其作为模板,PCR扩增出病毒全基因和结构基因(ORF2)。将PCR回收产物克隆到pMD18-T载体,成功构建了重组质粒pMD18-TPCV2和pMD18-T-ORF2,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的PCV2-XJ基因组全长1 768 bp。通过序列分析结果显示,PCV2-XJ与国内外PCV1、PCV2参考毒株的核苷酸同源性分别为99.5%～99.7%和68.7%;与HuB08(FJ041151)参考株核苷酸同源性最高(99.7%)。PCV2-XJ株ORF2基因与参考株核苷酸和氨基酸同源性分别高达99.3%和98.8%。

猪2型圆环病毒新疆株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV2)的核苷酸序列,设计了一对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出一株PCV2全基因组,将其克隆到pMD simple18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-PCV2。对此重组质粒进行序列测定及同源性分析,结果表明,该PCV2新疆株的全基因组大小为1 767bp,与其它PCV2核苷酸序列同源性为95.0%～99.6%,而与PCV1的同源性仅为76.8%～76.9%。

猪圆环病毒Ⅱ型ORF1基因的克隆与原核表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)ORF1基因序列,设计合成了一对引物,扩增出PCV2新疆株ORF1基因片段。将扩增出的ORF1基因(945 bp)插入到pMD18-T载体中,筛选获得重组质粒,命名为pMD18-ORF1。将ORFl酶切产物亚克隆到原核表达载体pET-32a中,获得重组质粒,命名为pET-32a-ORF1。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-32a中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为54 kDa,Western blotting分析结果表明,获得的融合蛋白可与PCV2阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性。

传染性支气管炎病毒山东分离株S_1基因的克隆及序列比较分析

参照Genbank中传染性支气管炎病毒 (IBC)M41纤突蛋白S1的基因序列 ,设计一对引物 ,对山东地区IBV分离株RNA进行反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR) ,成功扩增出约 16 34bpS1基因片段。将扩增出的S1基因分别克隆到TEasy质粒载体中 ,获得重组质粒 ,提取质粒DNA ,利用Eco .RI酶切证实了重组质粒的特异性 ,并进行序列测序。克隆出的序列已被GeneBank收录 ,序列号为 :AY0 4 3313。将得到的序列与标准株M41进行核酸序列和氨基酸同源性比较分析 ,与M41的核苷酸同源率99 %。利用Omigo 2 .0软件对克隆出的山东IBV进行了理论酶切位点分析 ,在BstYI、AluI和BgⅢ位点与M41不同。结合血清学和分子生物学实验结果推测