不同环境和营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌生长、产孢及几丁质酶表达的影响

[目的]研究温度、pH和不同营养条件对捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌(Arthrobotrys conoides)生长及产孢特性的影响,分析其在碳氮饥饿条件下几丁质酶的表达水平,优化该菌的培养条件,为该菌的扩大培养提供参考依据。[方法]将圆锥节丛孢菌AC-shz1菌株接种于YPSSA培养基,分别置于不同温度(15、20、25、30和35℃)、pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)、碳源(果糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素、几丁质)、氮源(甘氨酸、苯丙氨酸、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、尿素)和碳氮比(1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)环境条件下进行培养,观察并记录菌丝的生长速度及形态,测定其产孢能力;在碳氮源饥饿条件下,采用实时荧光定量PCR方法对4种几丁质酶基因的表达水平进行分析。[结果]圆锥节丛孢菌在温度15~30℃均能生长,其中以25℃时菌丝生长最快且产孢能力最强;在pH为6.5~7.5时菌丝生长良好,其中以pH 7.0时产孢能力最强。圆锥节丛孢菌最适菌丝生长和产孢碳源为葡萄糖和蔗糖,其中含葡萄糖的培养基产孢量最高;最适氮源为酵母粉和蛋白胨,含酵母粉的培养基产孢量最高,以葡萄糖和酵母粉为碳氮源的最适碳氮比为5∶1。与对照组相比,在碳饥饿条件下,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-14(AC-14,P<0.01)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-190(AC-190,P>0.05)基因转录水平上调,捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-379(AC-379,P>0.05)和捕食线虫真菌圆锥节丛孢菌几丁质酶-483(AC-483,P<0.01)基因转录水平下调;在氮饥饿条件下,上述4种几丁质酶基因转录水平均极显著下调(P<0.01)。[结论]菌丝生长和产孢最适温度为25℃,最适pH为7.0,最适碳氮源分别为葡萄糖和酵母粉,最适碳氮比为5∶1。本研究结果为进一步研发具有高效的捕食线虫真菌生物防控制剂奠定了基础。

兔须癣毛癣菌的分离及鉴定

本试验将从患皮肤病病兔采集的病料在沙氏培养基上培养1~2周,通过革兰氏染色镜检观察进行初步的病原鉴定。然后提取病原真菌DNA,利用设计的引物ITS1和ITS4进行PCR扩增技术测序,在GenBank数据库系统中进行比较,从而确定病兔感染真菌的病原分类。结果显示,菌落形态为白色粉末状,革兰氏染色后,在显微镜下可看见蓝紫色分生孢子,符合须癣毛癣菌的特点。ITS序列分析,该病原菌与须癣毛癣菌的同源性为97.4%。经过临床特征、形态学和分子生物学试验,最终确定从病兔身上采集到的病原菌为须癣毛癣菌。本研究对从病兔身上分离的病原菌进行形态学和分子生物学鉴定,确定其感染病原,为兔皮肤真菌病的预防和控制措施提供了理论依据。

蛙壶菌潜在分布区及其风险因素预测与分析

[目的]壶菌病是一种由蛙壶菌(Batrachochytrium dendrobatidis)感染导致的疾病,在近半个多世纪的时间里,是导致两栖动物种群数量大量减少甚至灭绝的主要原因之一。目前,壶菌病尚没有行之有效的治疗方法,因此,对世界范围内蛙壶菌的分布与传播进行调查研究,分析蛙壶菌在世界和区域尺度的分布风险及影响因素,可为其预防措施的制定提供基础研究资料。[方法]使用蛙壶菌在世界范围内的分布数据,共考虑了20个气候环境变量,经过对蛙壶菌分布数据和变量进行筛选,建立最大熵模型,比较纳入模型的6个变量与蛙壶菌分布风险的关系,并预测蛙壶菌在世界范围和中国大陆的分布风险。[结果]变量中对蛙壶菌分布概率贡献度最高的前4位依次为年平均气温、年降水量、温度季节性、降水季节性。蛙壶菌分布概率与年平均气温和温度季节性总体均呈先正相关后负相关,与年降水量和降水季节性分别呈正相关和负相关。蛙壶菌全球分布的高风险地区主要在中国大陆南部、澳大利亚东南部、巴布亚新几内亚中部、瑞典南部、德国、波兰、罗马尼亚、英国南部、爱尔兰、法国、马达加斯加东部、苏丹、美国南部、秘鲁东部、埃塞俄比亚和日本等。其在中国大陆分布的高风险区域主要集中在广东北部、广西中部和北部、云南、贵州、湖南、江西、福建、浙江、江苏南部、安徽南部、湖北南部、重庆、四川东部及南部、陕西南部等地区。[结论]蛙壶菌的分布与气温和降水关系密切,其在全球分布的高风险地区主要在欧洲、非洲南部和北美洲南部,在中国大陆分布的高风险区域主要集中在华中、华东、华南地区和西南地区的东南部。

产苦马豆素真菌的筛选与鉴定

为探明青海及内蒙古多种疯草类植物及其根际土壤中是否存在产生苦马豆素的真菌,并对其种属进行鉴定,同时测定其苦马豆素产率。本试验拟对采自内蒙古和青海的疯草样品中的内生真菌及根际土壤真菌进行分离;应用薄层色谱和气相色谱法分别检测菌丝及发酵液中苦马豆素含量,筛选可产生苦马豆素的真菌;运用形态学和分子生物学方法对其属种进行鉴定。从青海采集的疯草样品中分离并筛选出2株可产苦马豆素真菌,一株为土壤真菌,一株为内生真菌,分别命名为FS-5和EFG-7;菌丝中苦马豆素含量分别为0.773和0.11 mg.g-1,结合形态学和分子生物学试验结果,确定这2株真菌分别为裂褶菌属真菌和镰孢菌(霉)属三线镰刀菌。结果显示,我国青海疯草及根际土壤中存在可产生苦马豆素的真菌。

小花棘豆产苦马豆素内生真菌的筛选与鉴定

通过对小花棘豆内生真菌的分离纯化,筛选产苦马豆素内生真菌,探讨小花棘豆内生真菌与其毒性成分苦马豆素的相互关系。本研究对采自内蒙古西部草地的6份小花棘豆样品进行内生真菌分离纯化,采用薄层色谱和气相色谱技术对内生真菌发酵液进行苦马豆素定性、定量检测,筛选产苦马豆素内生真菌;结合形态学和分子生物学方法进行内生真菌种属鉴定。从小花棘豆样品中分离得到6株内生真菌。经筛选,其中有2株产苦马豆素,编号为XJ-J-I和XJ-H-1,其发酵液中苦马豆素产量分别为4.209 2mg.L-1和16.733 8mg.L-1。鉴定结果表明,这2株内生真菌虽然形态学存在差异,但基因型相同,同属镰刀属内生真菌—层出镰刀菌(Fusarium prolifera-tum)。小花棘豆中存在产苦马豆素内生真菌。

不同因素对疯草内生真菌合成苦马豆素的影响

研究不同因素对疯草内生真菌——Undifilum oxytropis合成苦马豆素的影响,筛选出显著影响U.oxytropis苦马豆素合成的因素。将U.oxytropis分别接种到不同pH或不同浓度聚乙二醇(PEG)、L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸的培养基中培养,测定菌丝及其发酵液中苦马豆素,分析各条件下真菌苦马豆素产率的变化。结果表明:当pH在4.5~6.5时,随pH增加,真菌SW产率显著增加(P<0.05);当PEG质量浓度在0~32g·L-1时,随PEG增加,真菌苦马豆素产率显著降低(P<0.01);当在培养基中添加相同量(10-3 mol·L-1)的L-哌可酸、L-赖氨酸、ɑ-酮戊二酸时,L-哌可酸添加组的苦马豆素产率显著降低(P<0.05),L-赖氨酸添加组苦马豆素产率显著增加(P<0.05);当L-哌可酸的初始浓度为10-3和10-2 mol·L-1时,真菌的苦马豆素产率显著下降(P<0.05),当其浓度为10-4 mol·L-1时,苦马豆素产率显著增加(P<0.01);当L-赖氨酸的初始浓度为10-1、10-2或10-4mol·L-1时,真菌苦马豆素产率显著降低(P<0.05)。当ɑ-酮戊二酸的初始浓度分别为10-1、10-2、10-3 mol·L-1时,真菌的苦马豆素产率显著降低(P<0.05)。由试验可知,低pH或添加PEG可抑制U.oxytropis中苦马豆素的合成,L-哌可酸、L-赖氨酸、α-酮戊二酸均对U.oxytropis的苦马豆素合成产生显著影响,但对苦马豆素合成的影响与各物质在培养基中的浓度密切相关。

不同培养条件对甘肃棘豆内生真菌多样性的影响

为探讨不同培养条件对中国甘肃棘豆内生真菌多样性的影响,本研究对采集于青海省祁连县甘肃棘豆的茎和叶部,运用表面消毒法将组织块分别置于黑暗和光照条件及PDA和BDA两种培养基上进行内生真菌分离纯化,采用形态学和ITS序列分析技术用于种属鉴定,并通过Biodap软件计算多样性指数。结果显示,629块植物样品中共分离到内生真菌433株,分属9个科15个属28种,不同培养条件优势菌属有所不同,总体而言,Undifilum oxytropis为优势菌属,且光照条件下更加明显;多样性指数计算结果显示,香农-维纳指数(H)为1.99,均匀度指数(E)为0.60,辛普森指数(D)为0.257,不同条件下多样性指数不同,黑暗条件下香农-维纳指数最高,光照条件下辛普森指数最大。结果提示,不同条件下内生真菌的分离率和多样性差异显著,黑暗条件下采用PDA培养基能提高内生真菌的分离率,黑暗条件下采用BDA培养基能增加内生真菌多样性,单就Undifilum oxytropis而言,光照条件下采用BDA培养基能提高其分离率。

直立黄芪中产苦马豆素真菌的分离与鉴定

为了确定直立黄芪中是否存在能产生苦马豆素的真菌及该类真菌与链格孢属波状芽管孢组疯草内生真菌的遗传进化关系,对直立黄芪植物组织中的真菌进行了分离,应用ɑ-甘露糖苷酶抑制法和超高效液相色谱-串联质谱法对分离菌株菌丝中的苦马豆素进行分析,筛选能够产生苦马豆素的菌株。PCR法扩增产苦马豆素真菌的内部转录间隔区(ITS)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)和β-酮脂酰合酶(β-ketoacyl synthase,KS)基因,测定其序列,进行序列一致性比对。基于ITS和GPD序列构建系统发育树,根据遗传进化分析结果和形态特征,对直立黄芪中的产苦马豆素真菌进行种属分类和命名。结果显示:从直立黄芪中共分离到43株真菌,其中有13株菌丝中含有苦马豆素,序列一致性和系统发育分析结果表明,该类真菌与已报道的直立黄芪病原真菌甘肃链格孢(Alternaria gansuense)和产苦马豆素疯草内生真菌(Alternaria Section Undifilum sp.)的亲缘关系最近。直立黄芪中存在能产生苦马豆素的真菌,根据形态特点和遗传进化分析结果,本研究将从直立黄芪中分离的产苦马豆素真菌划分到链格孢属波状芽管孢组中,并命名为甘肃波状芽管孢(Alternaria Section Undifilum gansuense)。

黄曲霉毒素B1降解菌的分离鉴定及培养条件优化

为筛选能降解黄曲霉毒素B1(AFB1)的细菌,对AFB1污染的饲粮进行生物脱毒。以AFB1结构类似物香豆素为唯一碳源和能源进行初筛,将含有标品AFB1(500μg/L)的发酵液进行复筛,通过菌落形态观察、生理生化试验及16S rRNA序列分析进行菌种鉴定,根据波长600 nm处测定的菌液的吸光值大小进行培养基成分优化。结果表明,分离到1株稳定的AFB1降解菌,通过形态、生理生化特征和16S rRNA序列同源性分析鉴定,该菌株为甲基营养型芽孢杆菌Bacillus methylotrophilus,命名为WZ-4,该菌株16S rRNA基因序列Gen Bank登录号为KJ855772。在温度36℃、p H值7.0、接种量5%条件下,在含有500μg/L的AFB1发酵培养基中培养72 h,WZ-4菌的降解率为75.25%。该菌生长的最佳碳源为麦芽糖,最佳氮源为蛋白胨。0.05%的Mg2+、Ca2+、Cu2+以及Fe3+对该菌株的生长均有抑制作用,其中Mg2+的抑制作用最小,Cu2+的抑制作用最大。

新鲜牛粪便中食线虫真菌的分离和鉴定

从 78个新鲜牛粪样中分离到 4株食线虫真菌 ( nematophagous fungi) ,通过对其菌丝体、孢子、捕食器官等的形态学观察、测定 ,2株鉴定为节丛孢属 ( Arthrobotrys)的寡孢节丛孢菌 ( A.oligospora) ,1株为指状节丛孢菌 ( A.dactyloides) ,1株为圆锥状节丛孢菌 ( A.conoides)。

2种捕食线虫性真菌生长特性和捕食效力比较

对少孢节丛孢菌 (Arthrobotrys oligospora Strain:A1)和纺锤隔指孢菌 (Dactylella ellipsospora Strain:Da1)的生长特性和捕食效力进行了比较。结果表明 :少孢节丛孢菌菌株与纺锤隔指孢菌菌株的最佳生长温度不同 ,前者为2 0℃ ,后者为 2 5℃ ;少孢节丛孢菌菌株对无氧条件有一定的耐受性 ,而纺锤隔指孢菌菌株在无氧条件下不能很好生长 ;少孢节丛孢菌菌株与纺锤隔指孢菌菌株分别在其最佳生长温度 (2 0℃和 2 5℃ )条件下 ,对马自然混合感染的线虫第 3期幼虫平均捕食率达 78.2 %和 80 .1% ,二者相比 。

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。

花生茎源茉莉炭疽菌的分离鉴定及生物学特性研究

旨在探究首次从花生茎中分离出茉莉炭疽菌(Colletotrichum jasminigenum)的生物学特性。通过三点接种法,经马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基分离培养,分别用乳酸酚棉蓝染色和扫描电镜观察其形态,提取分离真菌DNA,用PCR方法扩增ITS区并测序,比对该基因同源性及遗传进化关系。将孢子悬液以5×10^(7) CFU·mL^(-1)剂量感染昆明小鼠,并观察小鼠的临床症状、血清生化指标和剖检病变。用K-B纸片法探究其耐药表型。结果显示,分离株分生孢子长29.6μm±0.87μm,呈月牙形;菌丝透明无性,有隔和分枝,无刚毛;附着孢呈棍棒状或者卵球形。PCR扩增得到该菌ITS区序列长度为586 bp,序列提交GenBank(OR472966)。根据形态学结合ITS区序列分析结果确定分离株为茉莉炭疽菌,命名为SLY01。用SLY01菌株攻毒小鼠14 d后导致血清碱性磷酸酶含量极显著升高(P<0.01),肝脏器指数显著下降(P<0.05),并从感染小鼠体内再次分离鉴定出茉莉炭疽菌。组织病理学结果显示,试验组小鼠肺泡壁水肿伴有大量淋巴细胞浸润;肝细胞出现大面积颗粒变性,肝小叶内见出血和肝细胞坏死;肾可见肾小管上皮发生颗粒变性。药敏试验显示,SLY01菌株对卡泊芬净和伏立康唑耐药,对两性霉素B敏感,对伊曲康唑中度敏感。本研究分离鉴定得到茉莉炭疽菌,感染小鼠主要损伤靶器官为肝、肺,并且对多种药物耐药。这为进一步研究茉莉炭疽菌的防治提供理论依据。

口蹄疫病毒株OA/58 L蛋白酶的结构构建和功能分析

以口蹄疫病毒株OA/58 RNA为模板,反转录并扩增目的cDNA,然后与pGEM-T Easy载体连接并转化JM109菌株,提取的重组质粒用凝胶电泳、PCR和EcoR I酶切法鉴定。该毒株与A12,O1K,O1Campos和TW45/97毒株序列通过对比分析发现,L基因中有2个起始密码子,第二个是首选;并且确定氨基酸保守区主要位于第35～39,43～54,65～67,75～80,90～111,113～142,144～146,148～157,159～172和176～187位。L蛋白酶含有球状区域,碳端有一柔性杆状结构。合成的L蛋白酶可形成二聚体结构。第144位的Lys、148位的His和163位的Asp可能是L蛋白酶的活性位点。保守区氨基酸残基在维持蛋白的空间构像和功能方面具有重要作用。由拉马钱德兰图可证明本试验构建L蛋白酶的空间结构是合理的,它对于进一步的研究具有指导性。

应用聚合酶链反应检测鸡毒霉形体和滑液霉形体的研究

利用鸡毒霉形体（ＭＧ）与滑液霉形体（ＭＳ）基因一定区域互补的序列，合成能分别针对ＭＧ和ＭＳ目的基因的２对引物。用这２对引物对１０个国际标准的ＭＧ与ＭＳ菌株ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增，结果均得到与预期大小相一致的约７３２ｂｐ（ＭＧ）和２０７ｂｐ（ＭＳ）的ＰＣＲ产物。特异性试验结果表明，这２对引物对其它９种禽病病原ＤＮＡ或ＲＮＡ模板扩增均为阴性；敏感性试验结果显示，ＭＧＰＣＲ能检出１００ｆｇ的ＭＧＤＮＡ，ＭＳＰＣＲ检出量为１０ｆｇ的ＭＳＤＮＡ。

基于几丁质酶基因序列分析鉴定兔源须癣毛癣菌

利用几丁质酶基因(CHS1)序列分析和形态学方法对兔源须癣毛癣菌分离株(31株)进行鉴定和分型。从患兔采集病料,在沙保弱培养基进行分离培养,观察菌落和菌丝、孢子的形态及尿素酶、毛发穿孔等生理试验表现;提取病料和分离株DNA,扩增目的基因,通过序列分析,结合形态学方法对分离株进行鉴定,根据分离株序列同源性差异进行基因分型。结果显示,分离株的菌落多数为颗粒型和粉末型,占87.09%(27/31),背面有黄褐色素沉着,有大量葡萄状小分生孢子、螺旋菌丝、梳状菌丝及棒状大分生孢子,尿素酶试验和毛发穿孔试验阳性;CHS1序列比对显示分离菌株与须癣毛癣菌复合体的指间须癣毛癣菌有99.2%~95.4%相似性。根据CHS1序列比对结果,结合分离株的形态学特征,将该菌株鉴定为亲动物指间须癣毛癣菌。基于CHS1序列同源性差异,将分离株分成5种基因类型,其中Ⅰ型和Ⅱ型是优势菌株,占54.84%(17/31),提示CHS1序列分析可以用于须癣毛癣菌的鉴定和基因分型。

少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)表面聚合物的提取及生化性质研究

为了解捕食线虫性真菌——少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)捕食器表面聚合物的生化性质与作用,用5mol·L-1LiCl的表面聚合物提取液提取位于捕食器表面的这类物质,进而测定其中蛋白质的含量与酶的活性,并详细研究了温度、pH、化学试剂和蛋白酶抑制剂对其性质的影响。结果表明:2种不同来源的表面聚合物[表面聚合物(T+)与表面聚合物(T-)]最适温度均为65℃,前者最适pH为7.0,后者最适pH范围为6.5～7.5,且前者大相对分子质量蛋白质的浓度相对后者要高;同时还首次在含捕食器菌丝提取到的表面聚合物中检测到了蛋白酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的活性。通过研究初步了解了存在于捕食器表面并参与捕食过程的蛋白质类物质的相关化学性质,间接证实了上述物质可能在捕食过程中起关键作用,为今后深入开展对捕食线虫性真菌作用机理方面的研究提供了非常有价值的资料。

嗜线虫真菌Duddingtonia flagrans防制绵羊胃肠道线虫病

将 30只 4～ 6月龄羊分为 2组 ,分别在各自的围栏草场中放牧。用毛圆线虫和血矛线虫为主的第 3期幼虫对所有羊只人工感染 2次后 ,一组羊按每千克体重 1× 10 6 个的剂量每天饲喂嗜线虫真菌的厚垣孢子制剂 ;另一组羊作对照 ,仅饲喂等量的上述制剂基质——小麦。第 2次人工感染后 8周 ,2组羊粪便 EPG基本相近 ,但与对照组相比较 ,真菌组粪便培养物中感染性幼虫减少了 6 9.7% ;草场草样中感染性幼虫数也较对照组减少 6 7.8%。再把以上 2组羊驱虫后分别放养于上述围栏草场 ,8周后真菌组羊粪便 EPG较对照组减少 87.3% ;草场感染性幼虫也较对照组减少82 .6 %。上述结果显示 ,嗜线虫真菌 Duddingtonia

新生隐球菌病研究进展

隐球菌是条件致病性深部真菌,易发于细胞免疫功能受损的人群。新生隐球菌是隐球菌属的重要致病菌,属环境腐生菌,可从土壤和鸽粪中分离到,并被认为是人和动物最主要的传染源。医学方面,近年来由新生隐球菌引起的感染有逐渐增多的趋势,主要引起人的脑膜炎和肺炎。动物医学方面,可引起马的呼吸道病、牛羊的乳腺炎。鸽是隐球菌的自然宿主,但并不引起发病。该文从隐球菌病的病原特征、分类、毒力因子、致病性等生物学特性进行了概述,并对人和动物新生隐球菌病的传染和流行的基本环节、发病机制、临床表现、防治等方面的研究进展进行了综述。

兔须癣毛癣菌的分离与鉴定

利用rDNA ITS序列分析结合真菌形态学和生理学对兔的病原菌进行鉴定。提取菌株DNA,利用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,扩增产物测序后在GenBank核酸数据库中进行同源性比对。结果显示,分离株的菌落形态为白色粉末状,背面有色素沉着,培养可见大量葡萄状小分生孢子,螺旋菌丝及棒状大分生孢子;尿素酶和毛发穿孔试验阳性;rDNA序列比对结果显示,该分离菌株与须癣毛癣菌复合体中的万博节皮菌有99.8%同源性;从形态学和生理学试验符合须癣毛癣菌的特点,结合分子生物学试验将该菌株鉴定为万博节皮菌。