猪圆环病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中表达形成病毒样颗粒的研究

本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)PCV2b的ORF2基因插入供体质粒pFastBacTMⅠPPH启动子控制下的多克隆位点,构建的质粒转化DH10BAC感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-cap。将rBacmid-cap转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,间接免疫荧光试验证明目的蛋白在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得了表达。将该重组杆状病毒感染HighFiveTM细胞后,用Western blot在细胞培养上清中检测到了目的蛋白,并于d 5达到表达高峰。电镜观察结果显示上清中的目的蛋白可以装配成直径约为17 nm的病毒样颗粒。病毒样颗粒在培养上清中的大量存在,为目的蛋白进一步的分离和纯化提供了便利,也为PCV2基因工程疫苗的产业化奠定了基础。

猪圆环病毒2型减少猪肺泡巨噬细胞中伪狂犬病疫苗载量和CD80-CD86基因转录

【目的】探明猪圆环病毒2型(PCV2)干扰伪狂犬病疫苗(PRV)免疫效果的可能机制。【方法】用PCV2与PRV在体外分别单接种和共接种仔猪肺泡巨噬细胞(AM),在接种后不同时间用荧光定量PCR技术检测PRV载量与共刺激分子CD80-CD86mRNA水平的动态变化。【结果】PRV组上清中PRV载量在接种后都显著(P<0.05)高于PCV2+PRV组。与对照组相比,在接种后48h内,PRV组CD80mRNA水平在接种后增加并在48h时达到显著水平,而PCV2组与PCV2+PRV组的CD80 mRNA水平都显著减少;在接种后48h内,CD86mRNA水平在PRV组都显著增加,在PCV2+PRV组则都显著减少,但在PCV2组仅在接种后48h显著减少。【结论】PCV2能够减少猪AM中PRV载量与CD80-CD86基因转录,这可能是PCV2抑制PRV免疫效果的机制之一。

2013年云南省H9N2亚型禽流感病毒两个进化分支毒株抗原性变异分析

为明确2013年云南省H9N2亚型禽流感病毒Ⅲ-1和Ⅲ-2小分支间是否存在抗原性差异,以及这种抗原性差异是否与氨基酸位点变异有关,从2个小分支中选取7个毒株与疫苗株进行系统发育分析和血清学交叉比对试验。结果表明,2个小分支HA基因核苷酸序列同源性为86.6%~98.4%,与2000年前疫苗株亲缘关系较远,Ⅲ-1分支与2000年后疫苗株（ACKLGQ113和ACKDL2010）亲缘关系较近。血清学交叉比对试验结果经统计学分析显示,Ⅲ-1和Ⅲ-2小分支间抗原性存在差别。氨基酸比对结果表明,不同进化亚分支毒株与疫苗株相比氨基酸存在变异;与已报道的抗原表位关键性位点相比,Ⅲ-1分支中部分毒株抗原表位关键性位点存在变异,Ⅲ-2分支毒株无变异,但在其他8个氨基酸位点存在特有变异,是否存在未知抗原表位关键性位点,以及其他氨基酸位点变异是否会辅助性影响抗原变异,还有待进一步研究。

猪德尔塔冠状病毒实时荧光PCR检测方法的建立及初步应用

由猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)引起的腹泻,直接影响仔猪存活率和后期生长速度,严重的可导致死亡,是养猪企业重点监测的疫病之一。为了满足养猪企业对猪腹泻样本快速检测和排查的需要,本研究基于Taqman荧光探针技术建立了实时荧光PCR快速检测PDCoV的方法,并将其应用于猪场实际样品的检测。结果显示:本研究建立的实时荧光RT-PCR检测PDCoV的方法具有较高的特异性,可将PDCoV与同属的其他冠状病毒进行区分;其检测灵敏度比传统的PCR提高100倍;通过对大量临床样本的检测,证实该方法具有良好的稳定性,可在众多的腹泻临床样本中准确、高效地对PDCoV进行鉴定,从而减少养殖企业的损失。