华东地区家禽低致病性禽流感的病原学检测与带毒情况的分析

从2008年10月到2009年9月采集不同家禽的泄殖腔拭子共2420个,禽流感阳性样品178个,分离到AIVs毒株83株,总分离率7.36%。所分离到的亚型及各亚型分离率从高到低依次为H6、H3、H4、H9、H11、H1、H8。禽流感的分布季节性非常明显,以冬、春为高,各亚型又有其不同分布特点。水禽被认为是流感病毒的重要宿主,尤其是家鸭。到目前为止,作者已经从家鸭中分离到8种HA亚型,依次为H1、H3、H4、H6、H8、H9、H10、H11,7种NA亚型,包括N1、N2、N3、N4、N5、N6、N8。两者之间有18种组合,与野鸭的带毒情况十分相似。家鸭还很最容易发生混合感染,并以H6亚型为主,很多亚型都可与其混合感染,尤其是H3、H9亚型,这为基因重组产生新的亚型及毒力的变异提供了好的载体。

非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析.借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg2+、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4.5 mmol/L,400 nmol/L和500 nmol/L.同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为102个拷贝数的质粒,特异性为100%,CT(Cycle Threshold)值的变异系数CV小于5%.对送检的15份(是否感染ASFV不确定)猪肉样品进行检测,结果全为阴性.试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法.

基因Ⅶ型新城疫病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据Ⅶ型新城疫病毒基质蛋白基因保守序列设计并合成特异性引物,建立快速检测Ⅶ型新城疫病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。通过RT-PCR方法克隆Ⅶ型新城疫病毒M基因靶序列,并将其连入T-Easy载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品绘制标准曲线,其相关系数为0.999。检测结果显示,该方法的灵敏度可达100 copies/μL,而且特异性良好,除Ⅶ型新城疫病毒外,对Ⅱ型/Ⅲ型/IV型/Ⅸ型新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒检测结果均为阴性。本研究所建立的检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%。对40份实验感染样品的检测结果表明,其检出率为95%,而常规RT-PCR方法检出率仅为70%,表明该方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度更高、特异性更强。

小反刍兽疫07株H蛋白在昆虫细胞中的表达及其抗原性鉴定

应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,并对其抗原性进行鉴定。扩增小反刍兽疫病毒Tibet 07株H基因,克隆至p Fast Bac/CT-TOPO载体中,构建重组穿梭质粒p Fast Bac-PPRV-H,转化感受态大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H,转染sf9细胞,通过异源基因重组获得杆状病毒,通过病毒蚀斑试验检测扩增后病毒滴度。将P3代病毒以0.05MOI感染sf9细胞,通过SDS-PAGE鉴定H蛋白的表达,利用Western blot和间接免疫荧光鉴定H蛋白的抗原性。经过PCR、测序等证明重组杆状病毒Bacmid-PPRV-H构建正确。P2代重组杆状病毒的病毒滴度为1×107。表达的H蛋白在相对分子量约68 k Da处可见特异蛋白条带。感染的sf9细胞可与小反刍兽疫病毒H蛋白的单克隆抗体发生特异性反应。表明Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达了小反刍兽疫病毒西藏分离株Tibet 07的血凝素蛋白,为进一步研究其生物学功能及构建检测ELISA试剂盒奠定了试验基础。

禽副黏病毒4型荧光RT-PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank发表的禽副黏病毒4型(APMV-4)基因组序列,在保守区域分别设计了特异性RT-PCR引物和荧光探针,初步建立了可用于检测APMV-4的荧光RT-PCR方法。特异性试验表明本方法特异性强,与新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合征病毒(EDSV)等没有交叉反应。灵敏度试验表明本方法的检测下限为1 EID50,比常规RT-PCR的敏感度高100倍左右。本研究所建立的荧光RT-PCR方法具有快速、准确、灵敏等优点,可用于APMV-4样品的检测。

小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)快速荧光RT-PCR检测方法,应用DNAstar软件对来自NCBI上的PPRVN基因序列进行比对分析,在保守区设置引物和探针,经条件优化,建立PPRV荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该方法灵敏度高、特异性好、稳定性强,阳性结果与商用试剂盒的检测结果一致。结果表明该方法可用于PPRV的实验室检测。

小反刍兽疫病毒四川简阳株N基因的系统进化分析

为了调查小反刍兽疫病毒四川简阳株(SCJY株)的分子遗传特征,我们对四川简阳发病羊鼻拭子中的小反刍兽疫病毒N基因进行了遗传进化分析。通过RT-PCR、克隆测序获得SCJY株N基因序列,使用DNASTAR软件将其与GenBank中的15条参考株序列进行同源性比对,使用MEGA6软件进行系统进化分析。结果显示:SCJY株N基因序列全长1578nt,与参考株的核苷酸同源性为88.9%～100%,氨基酸同源性为92.8%～100%,与2013～2014年小反刍兽疫中国流行毒株高度同源;系统进化分析将16个毒株N基因划分为4个谱系,SCJY株属于Ⅳ系。

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及其应用

为了建立BVDV快速诊断方法,针对BVDV基因组5’UTR序列保守区域设计了荧光定量PCR引物,并建立了快速检测BVDV的荧光定量PCR方法。结果表明,以构建的重组质粒pMD-5’UTR为标准品建立的SYBR Green荧光定量PCR方法标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.997 3;敏感性试验结果显示,该方法敏感性较好,其最低检测下限为10拷贝。重复性试验结果显示,该方法批内和批间的变异系数为均小于5%,表明该方法的重复性良好。特异性试验显示,该方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒不存在交叉反应,但其不可区别鉴定BVDV与猪瘟病毒。应用所建立的SYBR Green荧光定量PCR方法测定非致细胞病变型BVDV(BVDV-BJ-2016株)分离毒株的一步生长曲线,发现在感染后12～48 h为其对数生长期。该研究为研究非致细胞病变型生长特性提供了参考。

2株鸽源新城疫病毒的毒力鉴定和基因型分析

2008年从临床鸽病例中分离到2株新城疫病毒毒株,经测定,鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为48h和46h,8周龄SPF鸡静脉接种指数(IVPI)分别为2.88和2.91,一日龄雏鸡脑内接种指数(IPCI)分别为1.88和1.89,按照OIE推荐的标准均为强毒株。RT-PCR扩增出融合蛋白(F)基因片段,测序,推导的氨基酸序列中蛋白酶裂解位点附近的氨基酸序列均符合强毒特征序列。根据F蛋白的部分基因序列绘制的系统进化发生树和F基因片段中3种限制性内切酶(RE)位点分布判定这2个毒株均为基因Ⅶc型。

基因Ⅶ型新城疫病毒融合前构象F蛋白的表达及结构分析

目前,新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的融合前构象是未知的,为获得具有融合前构象的NDV F蛋白,本研究对基因Ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化,将其克隆至真核表达载体中构建获得了重组质粒pCAG-optiF。通过SWISS-MODEL网站对蛋白结构进行预测,结果显示,质粒pCAG-optiF编码的蛋白能够形成与人呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象相似的结构。将质粒pCAG-optiF转染至鸡源细胞LMH中,通过间接免疫荧光试验证实构建的蛋白在鸡源细胞中成功表达。将质粒p CAG-optiF转染悬浮培养的Expi293F细胞,表达并纯化获得重组蛋白roptiF。SDS-PAGE电泳结果显示获得了与预期大小相符的蛋白。Western-blotting结果显示,表达的roptiF蛋白能够与NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的抗血清反应。进一步通过负染色电子显微镜观察roptiF蛋白结构,结果显示,roptiF蛋白具有典型的F蛋白融合前构象的结构特征。本研究成功获得了具有融合前构象的基因Ⅶ型NDV F蛋白,并且该蛋白能够与抗NDV的血清反应,本研究结果为研制新型NDV疫苗奠定了基础。