抑制p38 MAPK信号通路对Bpiv3复制的影响

由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3,Bpiv3)感染引起的牛副流感病已成为各国牛场最重要的传染病之一,每年都会给世界养牛业造成巨大的经济损失,但关于该病致病的分子机制研究较少。本研究通过观察Bpiv3感染对MDBK细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MKK3)及其下游分子p38丝裂酶原活化的蛋白激酶(p38MAPK)的表达的影响,探讨相关的信号转导机制,对p38 MAPK通路在Bpiv3感染过程中的作用进行了初步研究。Bpiv3感染细胞后,采用Western Blot检测MKK3,p38 MAPK在蛋白水平的表达变化,并采用ELISA法检测细胞上清中IL-6,IL-8,IL-13和TNF-α的水平变化,采用SPSS 12软件进行统计学分析。结果表明,Bpiv3在感染后能够诱导MKK3的激活以及p38的磷酸化,激活了p38 MAPK信号通路。而且p38 MAPK信号通路参与了Bpiv3的复制过程。ELISA检测Bpiv3感染后以及使用抑制剂SB202190处理后的细胞上清中IL-6、IL-8、IL-13和TNF-α的水平发现,p38 MAPK信号通路参与了Bpiv3诱导的炎症反应。研究证实Bpiv3感染能够激活p38 MAPK通路,显著上调MKK3的表达并诱导p38发生磷酸化,进一步激活下游分子发挥生物学活性,促进Bpiv3的复制及诱导促炎细胞因子的产生。p38 MAPK信号通路的激活可能是Bpiv3感染诱发炎症反应的机制之一。

新城疫病毒F蛋白与鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白的共表达、纯化及免疫原性

目的共表达新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F蛋白与鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白,纯化并分析其免疫原性。方法根据NCBI中NDV F及IBV S1片段基因序列,截取包含F及S1蛋白部分抗原表位基因片段,设计并合成引物,PCR扩增目的片段,依次连接至原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-32a-F-S1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达,并对IPTG浓度和诱导时间进行优化,SDS-PAGE分析目的蛋白可溶性;重组蛋白经Ni-NTA agarose层析纯化复性后,Western blot法检测其反应原性。将14日龄雏鸡随机分F-S1、NDV F、IBV S1及PBS组,肌内免疫3轮,间隔10 d,每轮连续免疫5 d,每日1次,100μg/只,首次免疫后每隔7 d采集血清,ELISA法检测雏鸡血清特异性IgG水平。结果经双酶切鉴定,重组质粒p ET-32a-F-S1构建正确。重组蛋白最适IPTG诱导浓度为0.2 mmol/L,时间为3 h;其以包涵体形式存在,相对分子质量约为53000;纯化的重组蛋白能与抗NDV及抗IBV阳性血清反应,浓度为1.04 g/L。雏鸡免疫7~49 d,与PBS组比较,F-S1、NDV F及IBV S1组血清IgG水平均显著升高(P<0.01)。结论成功制备了重组蛋白F-S1,该蛋白具有良好的反应原性,能诱导雏鸡机体产生体液免疫应答,为NDV F及IBV S1重组蛋白的后续应用奠定了基础。