犬细小病毒层析纯化方法的建立

病毒纯度是抗体制备和疫苗免疫效果提升的关键,本文利用Purose shell V15离子交换层析和Sepharose 4FF分子筛层析分别建立了犬细小病毒(CPV)的纯化方法。将CPV经过离心澄清和膜包浓缩后,用AKTA蛋白纯化仪结合Purose shell V15和Sepharose 4FF分别进行纯化,最后使用超滤管浓缩,通过病毒含量测定、总蛋白回收率测定、SDS-PAGE、Western blot和电镜观察分析病毒的纯化效果。结果:2种方法纯化后病毒形态典型,病毒颗粒大小约20 nm,总蛋白去除率97%以上,回收率71%以上;Purose shell V15纯化后的病毒经SDS-PAGE和Western blot分析显示无细胞成分的杂带,而Sepharose 4FF纯化后的病毒有少量的牛血清白蛋白条带。本试验结果表明这2种方法均可用于CPV的纯化,Purose shell V15纯化后的病毒纯度更高。

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因的融合表达

禽流感病毒(AIV)非结构蛋白NS1在病毒粒子中不存在,因此,可以通过检测NS1抗体来鉴别禽流感病毒感染鸡群和免疫鸡群.将ns1基因和T4噬菌体soc基因在大肠埃希氏菌中融合表达,融合蛋白可以作为鉴别禽流感免疫鸡群和感染鸡群的检测抗原.采用RT-PCR方法扩增禽流感病毒H9N2的ns1基因(654 bp);将该片段克隆至pSOC质粒soc基因3′端,成功构建了重组质粒pSOC-NS1,用该重组质粒转化E.coliB l21(DE3)感受态细胞,以终浓度1 mmol/mL的IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果表明pSOC-NS1融合蛋白相对分子质量约39 000.W estern-b lot证实,表达产物与AIV H9N2病毒感染的小鼠血清具有良好的反应性.

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体,转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell,DC)。方法:将pMD-18-VP1克隆于pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒,酶切鉴定,DNA测序证实序列正确后,利用脂质体将重组质粒转染DC,经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆,用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达。结果:构建的pcDNA3.1-VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性,SDS-PAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1。结论:成功地构建了重组质粒pcDNA3.1-VP1真核表达载体,并在DC中得到稳定表达。

禽传染性支气管炎病毒免疫原基因的PCR获取及其酶切鉴定

介绍用ＲＴ－ＰＣＲ（反转录－聚合酶链反应）获取禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）Ｍ４１株和广东地方致弱株Ｄ４１免疫原（Ｓ１）基因的详细方法，所用引物为ＩＢＶＢｅａｕｄｅｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列，跨幅为１．７ｋｂ。结果表明，两株病毒所获的ＰＣＲ产物与预期的一致；用此对引物，以ＩＢＶＤ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物为模板，扩增出一样的ＤＮＡ片段。试验还显示，国内外几家公司有关ＲＴ和ＰＣＲ的分子生物学试剂可以兼用，适用于国内的有关研究；ＰＣＲ仪则以进口的或水浴锅式的为佳。对ＩＢＶＭ４１株Ｓ１基因的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行ＨａｅⅢ酶切图谱分析。

H7亚型流感病毒通用及区分强弱毒RT-PCR方法的建立

为建立可以区分H7亚型流感病毒强弱毒的方法,根椐Genbank和GISAID中H7病毒的HA基因序列,设计2条特异性引物,建立了扩增H7病毒HA裂解位点区域的通用RT-PCR方法。在此基础上,在裂解位点处设计1条引物,建立了可以区分H7强弱毒的RT-PCR方法。该方法对弱毒株可以扩增出约337 bp的片段,对强毒株可以扩增出约349 bp和227 bp的片段,对其他常见亚型流感病毒的RT-PCR扩增均为阴性。敏感性试验结果表明,该RT-PCR方法的检测下限为1 fg的H7N9病毒模板。该方法对10份实验室已鉴定好的H7N9病毒进行对比验证,两者的符合率为100%。试验结果表明,该方法具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7亚型流感病毒的快速检测,同时还可区分强弱毒,对H7N9病毒,尤其是高致病性病毒的早期诊断和有效防控可提供有效技术支撑。

黄霉素产生菌在发酵过程中菌丝体内外效价的变化研究

通过对黄霉素产生菌在整个发酵过中菌丝体内外效价变化过程的跟踪分析,发现黄霉素在发酵过程中是菌丝体内外兼有而且是有一定变化规律的。该研究结果可为今后的工作和研究及发酵调控过程提供正确指导。

野生动物园不同源性大肠杆菌耐药性及PFGE分型研究

为了解福州动物园内不同源性大肠杆菌的耐药性及亲缘情况,为大肠杆菌病防治提供依据,笔者用微量肉汤法对8种抗菌药物进行药敏试验、PCR法检测intⅠ1、blaamp C、gyr A基因,并采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法对分离自不同源性的大肠杆菌进行DNA指纹图谱分型,比较菌株之间的亲缘关系。结果显示,不同源性大肠杆菌耐药率为84.30%,其中复方新诺明(66.94%)、四环素(65.29%)和头孢唑林(48.76%)耐药率最高;多重耐药以2~4重耐药为主,占67.86%;intⅠ1基因检出率为24.79%,gyr A基因检出率为83.47%,blaamp C基因检出率为85.95%;PFGE分型结果显示,各菌株之间相似系数大部分在40%~75%之间,少数在70%~75%。结果表明,福州动物园内大肠杆菌整体耐药情况较严重,intⅠ1、blaamp C、gyr A基因与多重耐药具有相关性;动物源性、环境源性和人员性之间存在的多重耐药大肠杆菌之间未发现同一菌株的垂直克隆传播,没有流行病学相关性。

细胞骨架抑制剂对狂犬病病毒感染人神经瘤细胞的影响

为检测细胞骨架抑制剂对狂犬病病毒(RABV)感染细胞的抑制作用,筛选了秋水仙素(Col)和细胞松弛素D(CytoD)2种骨架特异性抑制剂在人神经瘤细胞SH-SY5Y上的适宜浓度,探讨其对RABV感染及复制的影响。结果表明:随着细胞骨架抑制剂浓度的升高,微管和微丝的破坏加剧;当Col浓度分别为0.065 mmol/L和0.130 mmol/L及CytoD浓度分别为0.25μg/mL和0.50μg/mL时,微管、微丝结构及细胞活力均与对照组无显著差异(P>0.05),2种骨架抑制剂对RABV的感染及复制均有抑制作用。通过对RABV培养物的OD值和G基因mRNA的定量检测,发现CytoD对RABV感染的抑制作用较Col更明显,Col对RABV复制的抑制作用较CytoD更明显。

牛病毒性腹泻病毒可视化一步RT-LAMP检测方法的建立

为建立可视化一步RT-LAMP检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,根据GenBank中的BVDV的5′UTR序列,设计2组RT-LAMP引物,经过反应温度、反应时间、Mg^(2+)和甜菜碱的终浓度的优化,特异性及灵敏性试验,对3种常用显色指示剂钙黄绿素-MnCl_(2)、羟基萘酚蓝和中性红的显色效果进行评估,并使用商品化ELISA试剂盒与本方法进行对照试验。结果显示,经优化本方法在66℃30 min即可完成反应,采用中性红作为显色指示剂,检测BVDV可产生特异阳性反应;对BVDV RNA检测下限最低达0.021 pg/μL;对13份临床样品检测结果与商品化ELISA检测试剂盒相符率100%。结果表明,所建立的BVDV可视化一步RT-LAMP检测方法的特异性、灵敏性较好,可为BVDV临床快速检测提供帮助。