猪肺炎支原体通过抑制SPLUNC1功能破坏呼吸道炎性反应平衡

【背景】猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)通过定植猪呼吸道黏膜层,破坏呼吸道炎性反应平衡,引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1)是呼吸道黏膜分泌的具有重要抗菌和抗炎功能的蛋白,被认为是呼吸道黏膜面对危险信号时的“信号传感器”。【目的】从Mhp和SPLUNC1相互作用入手,分析Mhp感染对SPLUNC1表达的影响以及SPLUNC1对Mhp引起的炎性反应的调控作用,揭示Mhp引起炎性损伤的新机制,为解决Mhp持续性感染问题提供参考。【方法】利用猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞(porcine bronchial epithelial cells,PBECs)感染模型和猪体感染模型,通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western-blotting等方法,分别检测Mhp感染后对肺脏中SPLUNC1以及体外PBECs中SPLUNC1转录和表达的影响。克隆并扩增猪源SPLUNC1基因通过酶切鉴定,构建成功SPLUNC1真核和原核表达重组质粒pCDNA3.1-SPLUNC1以及pET28a-SPLUNC1。与此同时,设计靶向SPLUNC1的siRNA干扰片段。利用体外SPLUNC1蛋白孵育、体内呼吸道黏膜SPLUNC1抗体封闭,通过Mhp CCU50检测明确SPLUNC1对Mhp体内外生长的影响。在猪支气管上皮细胞中,通过过表达或siRNA干扰SPLUNC1基因,后感染Mhp,利用Western-blotting、间接免疫荧光以及酶联免疫吸附方法,明确SPLUNC1对Mhp的黏附作用、诱导炎性因子表达以及MAPK信号通路活化的影响。【结果】Mhp感染猪后可引起肺脏实变,主要组织病理表现为肺脏炎性损伤,同时显著上调肺泡灌洗液中趋化因子CXCL8和炎性因子TNFα和IL-1β分泌。Mhp体内外感染后,体内肺脏和体外猪支气管上皮细胞中SPLUNC1的转录和表达均显著下调。以上研究表明,Mhp可诱导肺脏炎性反应,抑制SPLUNC1表达。另一方面,体外PBECs中过表达SPLUNC1后,Mhp感染引起的CXCL8表达显著减少;siRNA干扰SPLUNC1后,Mhp感染引起的CXCL8表达显著增加,表明SPLUNC1负调控Mhp感染引起的CXCL8表达。基于Mhp感染入侵呼吸道过程,本研究进一步解析SPLUNC1负调控CXCL8表达的机制。结果表明:无论是SPLUNC1和Mhp体外孵育,还是SPLUNC1抗体体内封闭,Mhp的体内外生长均未受影响;SPLUNC1的过表达或siRNA干扰对Mhp体外黏附PBECs的能力也无显著影响;过表达SPLUNC1可抑制pERK和IκBα的激活,相反SPLUNC1 siRNA干扰后,可促进pERK和IκBα的激活。以上研究证明SPLUNC1不是通过调控Mhp的生长和黏附,而是通过负调控MAPK-ERK通路的活化来调控CXCL8的表达。【结论】SPLUNC1可通过MAPK-ERK信号通路来调控炎性因子的过度表达,维护宿主炎性平衡;与此同时,Mhp感染后可通过抑制SPLUNC1的表达来破坏宿主炎性反应的平衡调控,进而引起炎性损伤。本研究为解析Mhp感染损伤机制提供依据。

猪肺炎支原体LAP的结构预测及其抑制剂Bestatin对支原体生长的影响

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。本研究拟以猪肺炎支原体(Mhp)LAP为模型,研究其理化特性和高级结构,探索LAP抑制剂乌苯美司(Bestatin)对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较,分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白,通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白,圆二色谱测定LAP的二级结构,用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高,但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后,分子筛层析显示LAP是六聚体,圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制,且呈现剂量依赖性,但在不同菌株间存在差异,最低在6μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供了新的思路。

5种猪源消化道传播病原体荧光定量PCR检测方法的建立

猪源人兽共患病不仅威胁公共卫生安全,还威胁生猪养殖业的健康发展;其中消化道传播是其主要的传播途径。为及时鉴定出经消化道传播的病原体,本试验建立了猪源大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌和志贺菌的四重荧光定量PCR和戊型肝炎病毒荧光定量PCR检测方法,并优化反应体系和条件,实现5种病原体的同时检测;并利用荧光定量PCR与普通PCR对117份猪临床样品(病变组织、粪便和肌肉等)进行对比检测。结果显示,建立的荧光定量PCR能够在1.5 h内完成对大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒5种病原体的特异性检测,与其他常见细菌和病毒无交叉反应,检测极限值可达5个拷贝,标准曲线相关系数均不低于0.997,线性范围涵盖1×10^(1)~1×10^(9),批内和批间变异系数(CV)均低于3.16%。建立的荧光定量PCR与普通PCR方法检测结果的符合率达到95.73%~100%,具有较好的一致性。117份临床样品中大肠杆菌、沙门菌、单增李斯特菌、志贺菌和戊型肝炎病毒各自的阳性率分别为31.62%、17.95%、6.84%、5.13%和11.11%。结果表明,本试验所建立的荧光定量PCR方法灵敏、特异、稳定,能够同时、快速区分检测上述5种猪源消化道传播病原体,可为猪肉制品从产地到餐桌全环节样品的监测提供有力的技术支持。

参姜止痢合剂治疗仔猪黄痢的临床疗效评价

为验证参姜止痢合剂治疗仔猪黄痢的临床疗效,从兰州周边养猪场搜集疑似病例,经流行病学调查、临床症状观察作出初步诊断,通过实验室细菌学检查进行确诊后,采用参姜止痢合剂进行治疗,观察给药后病猪精神状态、饮食和腹泻情况,采用普通血平板培养基和大肠杆菌显色培养基测定给药前后仔猪粪便中大肠杆菌的数量。结果显示,用药治疗后的仔猪精神状态明显好转或恢复正常,病猪粪便中大肠杆菌数量明显减少,3个养猪场(景泰县王德香养猪场、甘肃蟾慕农业科技有限责任公司和永登县苗中俊养猪场)的黄痢治愈率分别为87.6%、89.1%和84.1%。结果提示,参姜止痢合剂治疗仔猪黄痢效果较好,为今后研发新药提供了试验依据。

表达猪源GM-CSF重组PRRSV疫苗对同源高致病性毒株的免疫保护效力评价

为研究表达猪源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在动物体内的免疫调节特性及对其的保护效力评价,本研究将15头30日龄仔猪随机分成4组,空白对照组(DMEM)4头、疫苗对照组(HuN4-F112株)4头、疫苗组(rPRRSV-GM-CSF株)3头和攻毒对照组(DMEM^(+)HuN4株)4头。疫苗对照组肌注免疫HuN4-F112株10^(5) TCID_(50)/头、疫苗组肌注免疫rPRRSV-GM-CSF株10^(5) TCID_(50)/头,实验空白组和攻毒对照组肌注DMEM 2 mL/头,免疫后28 d,疫苗组、疫苗对照组和攻毒对照组肌注HuN4株(10_(5) TCID_(50)/头)。攻毒后的试验结果表明,免疫rPRRSV-GM-CSF重组病毒组和疫苗株HuN4-F112组获得完全保护,阴性对照组全部死亡;通过IDEXX试剂盒检测仔猪血清中PRRSV抗体水平可知,在免疫14 d后,疫苗组抗体水平显著高于疫苗对照组(P<0.05);由流式细胞术分析体内免疫细胞亚群比例可知,疫苗组同疫苗对照组相比,疫苗组的重组疫苗株能够引起免疫记忆细胞亚群CD4^(+)CD8^(+)T在免疫后28 d显著升高,以及引发攻毒后其抗原递呈细胞显著增多,进而促进CD4-CD8^(+)T的增殖以发挥抗病毒免疫应答。本研究筛选出了一株具有改善HuN4-F112弱毒疫苗株免疫效果的重组病毒rPRRSV-GM-CSF,为进一步研发广谱通用的新型疫苗奠定基础。

基于RNA-Seq技术筛选姜曲海猪子宫和卵巢发育相关基因

母猪的子宫和卵巢组织发育情况直接影响母猪的繁殖性能,进而对养猪业的经济效益造成重大影响。为探究姜曲海猪子宫和卵巢发育的分子机理,本研究选取1月龄和8月龄姜曲海猪各3头,利用转录组测序技术(RNA-Seq)对子宫和卵巢组织进行测序,通过生物信息学手段筛选差异表达基因并进行基因本体(Gene ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto ncyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,再与猪数量性状基因座(Quantitative trait locus,QTL)数据库比对后鉴定出重要的候选基因。结果显示,1月龄和8月龄姜曲海猪子宫组织中有1688个差异表达基因,表达上调和下调的基因各844个;卵巢组织中存在3833个差异表达基因,其中2831个表达上调,1002个表达下调。富集分析结果显示这些差异表达基因主要显著富集于动物器官发育、组织发育和细胞分化等生物学过程。本研究在子宫和卵巢组织中分别筛选出11个和31个与发育性状有关的候选基因,其中共有的候选基因有6个,分别为LHFPL1、MTUS2、LIF、RBP4、EPHB2和TESC。本研究结果为姜曲海猪子宫和卵巢发育分子层面的研究提供了参考,也为今后姜曲海猪繁殖性状的分子改良提供了新的研究方向。

猪多种病原混合感染临床诊断与防控

随着猪养殖业的发展,猪多种病原混合感染在养殖业中的发生率也越来越高。混合感染不仅会对猪的生产性能和免疫力造成严重影响,还会给猪的健康和养殖业的可持续发展带来巨大威胁。因此,针对猪多种病原混合感染的临床诊治显得尤为重要。混合感染的病原体类型多种多样,临床诊断和治疗的难度较大。同时,混合感染的病情也可能十分复杂,需要综合考虑病原体类型和数量、猪的免疫状态、环境条件等多个因素,制定合理有效的治疗方案。本文对猪疾病混合感染的临床诊治进行了简要介绍,旨在帮助养殖从业人员更好地了解和掌握这一重要问题的诊治方法,提高猪的健康水平和养殖业的发展水平。

不同药方对硒都黑猪喘气病的临床效果研究

为评价不同药方治疗硒都黑猪喘气病的临床效果,选择120头临床出现喘气病症状硒都黑肥猪,随机分成4组,每组30头。使用不同药物组合进行治疗,观察4组病猪治疗期间显效率、总有效率、死淘率、平均日增重等指标。结果表明,泰万菌素和黄芪多糖组治疗效果最优,显效率为63.3%,总有效率为93.3%,死淘率为0,平均日增重达450.8 g。结论:临床上防控硒都黑猪喘气病首选泰万菌素和黄芪多糖。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的持续感染和传播特点及防控出路

1PRRS简述。1987年,美国首次暴发猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),随后在世界各国陆续暴发该病,截至目前PRRS已遍布世界主要的养猪业国家,成为各国养猪业最为严重的疫病之一,每年给全球养猪业造成数十亿甚至上百亿美元的经济损失。

猪蓝耳病的综合防治措施

猪繁殖与呼吸综合征病毒属于动脉炎病毒科的一种病毒,猪只感染该病毒可以引发繁殖障碍和呼吸道综合征,又称猪蓝耳病。该病具有致死率高,传染性强,发病突然等特点,对养猪生产危害很大。本文通过分析发病的病因,根据临床诊疗效果提出猪蓝耳病的综合防治措施,供广大养猪户参考和借鉴,以期降低猪蓝耳病对养猪生产造成的损失。

2022年湖北地区猪流行性腹泻流行病学调查

1材料所有病猪材料均来自湖北地区猪场送检的猪腹泻样本。全自动PCR分析系统(Gentier 48R),购自天隆科技有限公司。核酸提取仪(VNP-32P)购自南京诺维赞医疗科技有限公司。核酸提取试剂盒(Fastpure Viral DNA/RNA Mini Kit V2),购自南京诺维赞医疗科技有限公司,细菌核酸提取试剂盒(Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒),购自杭州博日科技股份有限公司。

复方银花口服液防治仔猪细菌性腹泻效果

为评估复方银花口服液对仔猪细菌性腹泻的防治效果,选取新生健康仔猪和哺乳腹泻仔猪,开展复方银花口服液对新生仔猪腹泻的预防效果及其联用四黄止痢颗粒治疗哺乳仔猪腹泻的疗效试验。结果显示:复方银花口服液对新生仔猪腹泻预防保护率为91.1%,较恩诺沙星注射液高30.6%;联用四黄止痢颗粒对哺乳仔猪细菌性腹泻的总有效率为88.2%,较恩诺沙星注射液高35.9%。研究表明:复方银花口服液对新生仔猪腹泻有较好预防效果,与四黄止痢颗粒联用可用于临床耐药细菌性腹泻的治疗。

新疆某规模化猪场3种病毒病抗体监测分析与免疫程序优化

该试验旨在了解当前新疆巴州某规模化猪场猪瘟(CSF)、猪蓝耳病(PRRS)和伪狂犬(PR)疫苗的免疫水平,收集当地某规模化生猪养殖场的467个血清样品,采用ELISA抗体检测试剂盒检测血清中猪瘟、猪蓝耳病和猪伪狂犬病毒的抗体水平。结果显示,该地区的猪瘟、猪蓝耳病和猪伪狂犬病毒平均血清抗体阳性率分别为93.68%、77.22%和92.65%,均超过我国强制性疫苗免疫抗体阳性率标准70%。该地区猪群免疫手段还有很大的进步空间,本研究结合该地区实际情况对免疫程序进行了相应的调整优化。

关于我国种猪场猪肺炎支原体净化的思考

猪肺炎支原体是一种对生猪影响较大的细菌性病原体,往往可引起猪群发生慢性感染,且难以从猪群和猪场水平上清除,导致养猪业遭受巨大的经济损失。猪肺炎支原体净化在欧洲和北美已全面启动,且有成功案例,我国才刚刚启动。本文结合国外猪肺炎支原体净化方案的经验与我国生猪养殖特殊性的分析,提出分群体、分阶段的“三步法”净化建议,并对我国猪肺炎支原体的净化提出了展望。

浅谈生猪养殖场生物安全体系建设

搞好猪场的疫病防控非常重要,猪场往往因为对于猪病传播渠道防范不到位而引起动物疫病的发生,给猪场造成巨大的经济损失。为了预防猪场疫情和改善猪场生态环境,本文从外部生物安全和内部生物安全2方面阐述了阻止疫病传播的措施以及疫病发生后的紧急处理预案,建立了规模猪场生物安全防控体系,为生猪养殖提供借鉴和参考。

1株5型副猪格拉菌的分离鉴定及生物学特性研究

副猪格拉菌是猪的一种重要病原菌,给世界养猪业带来较大的危害和经济损失。开展副猪格拉菌的分离鉴定及特性分析研究工作,有助于为临床诊断治疗及预防提供依据。该试验对临床发病的仔猪病料进行细菌分离培养鉴定,采用革兰氏染色、生化鉴定、PCR扩增、测序比对、遗传进化分析、基因分型等方法对分离菌株进行鉴定分析,同时对其进行药敏试验及致病性研究。结果显示,分离得到副猪格拉菌,同源性分析结果显示该菌株与副猪格拉菌不同参考菌株之间的相似性介于92.3%~95.6%,基因分型显示分离株为基因型5型。分离菌株对多西环素、阿莫西林敏感,对新霉素、泰乐菌素、复方新诺明和头孢噻吩耐药。小鼠致病性试验显示其具有致病性。本试验相关结果为副猪格拉菌临床防控及治疗提供理论依据。

Sharpie marker在试管上标记对荧光PCR检测Ct值的影响

为了探明Sharpie marker在试管上标记对荧光PCR检测Ct值的影响,本试验模拟现实工作中可能遇到的各类情形,从Sharpie marker标记试管的各种方式,以对照组、全黑管、管壁全黑管、管壁和盖半黑管、管壁半黑管、盖半黑管和盖全黑管等为对象,通过荧光PCR检测,比较分析Ct值。结果显示,全黑管和盖全黑管对Ct值的影响最大,管壁和盖半黑管与盖半黑管对Ct值的影响较大,而管壁全黑管和管壁半黑管对反应Ct值没有影响。本研究为正确使用Sharpie marker,确保荧光PCR检测结果的准确提供了参考。

猪病毒性腹泻有效防控——生猪产业无法回避的现实问题

猪病毒性腹泻并不是一种传染病,而是一大类感染消化道病毒病的统称,因其临床症状均导致腹泻而得来,其病源包括4种猪肠道冠状病毒和猪轮状病毒(PoRV)。猪肠道冠状病毒主要包括猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和新发的猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)。

猪瘟疫苗的研究现状与发展趋势

猪瘟是由猪瘟病毒感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,主要特征是发病急、高热稽留和细小血管壁变性,从而引起泛发性小点状出血、梗死和坏死。该病传染性强,病死率高,对养猪业危害巨大。OIE将其列为法定报告疾病,我国将其列为一类动物疫病。猪瘟病毒是其病原体,尽管猪瘟病毒各个毒株的毒力不同,但是它们都使养猪业产生了巨大损失,威胁着全世界的猪肉生产和国家人口的粮食安全。

猪圆环病毒病流行现状、新型疫苗与防控措施

1猪圆环病毒病概述。猪圆环病毒病是一种动物病毒。在20世纪90年代,世界范围内人们在病猪及一些无明显临床症状猪体内检测到了一种新型猪小环装样病毒。该病毒与已知的由PK-15细胞培养污染而分离的猪圆环病毒(Porcine circovirus,缩写:PCV)不同。