新疆维吾尔自治区阿拉尔市某规模化养殖场猪乳源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及其毒力、耐药性分析

[目的]分离鉴定新疆维吾尔自治区阿拉尔市猪乳源金黄色葡萄球菌,了解其致病性和耐药性。[方法]从阿拉尔市某规模化养殖场收集6份新鲜猪乳样本,采用甘露醇高盐琼脂(MSA)培养基分离乳样中的金黄色葡萄球菌,利用表型鉴定方法及细菌16S rDNA序列分析法对分离到的菌株进行鉴定,检测分离菌株的生物被膜形成能力,利用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验,利用PCR法检测毒力基因和耐药基因。[结果]经分离培养及分子生物学鉴定,从6份乳样中获得2株金黄色葡萄球菌,分离率为33.33%(2/6);2株金黄色葡萄球菌均具有强生物被膜形成能力(+++);2株金黄色葡萄球菌均对利福平敏感,均对青霉素、头孢西丁、四环素、红霉素、替米考星、克林霉素和磺胺甲噁唑耐药;在检测的5种耐药基因中,2株金黄色葡萄球菌均携带ant(4)基因和mecA基因;在检测的20种毒力基因中,共检测到6种毒力基因,其中,2株金黄色葡萄球菌均携带seg、sei、hlb、fnbA、clfA基因,有1株携带hla基因。[结论]该养殖场猪乳源金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力强,携带多种毒力基因和耐药基因,表现为多重耐药性。

中草药复方对猪常见致病菌的体外抑菌试验

将黄芪、黄芩、麦芽、甘草、党参、茯苓、白术7种单味中药按2∶1∶1∶1∶2∶2∶2比例混合后,经水煎煮制成浓度为1 g/mL的溶液,分别采用平板打孔法和平皿二倍稀释法对猪致病性大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌进行体外抑菌试验,考察抑菌效果。结果表明:该复方中草药水煎剂对巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌抑菌效果为低敏,对大肠杆菌无抑菌作用;对猪致病性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为0.10、0.05、0.10 g/mL,对大肠杆菌最低抑菌浓度(MIC)>0.10 g/mL。由此可知,该复方中草药水煎剂对巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有不同程度的抑菌作用,且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于对巴氏杆菌和沙门氏菌的,而对大肠杆菌的抑菌作用甚微。

猪链球菌2型体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞的炎症相关细胞因子mRNA转录分析

为探明猪链球菌2型(SS2)感染的致病机制,利用荧光定量PCR方法,分析不同SS2菌株对3D4/21猪肺泡巨噬细胞各炎症相关细胞因子mRNA体外转录水平的影响。结果显示强毒菌株ZY05719刺激细胞因子转录水平高于其impdh缺失株ZY05719(Δimpdh)和无毒菌株HA0609及低毒菌株CS100322-1。ZY05719诱导多个细胞因子mRNA过度转录,包括IL-18、IL-8和IL-12等。除IL-10外,HA0609诱导其他细胞因子mRNA上调转录;而CS100322-1刺激后,绝大部分细胞因子mRNA处于稳定状态。不同毒力SS2菌株影响细胞因子mRNA转录,且这种影响具有时间上的依赖性。SS2具有调节炎性细胞因子转录的能力,其结果介导炎症反应及白细胞趋集于感染部位,这可能是SS2引起脑膜炎炎症特征的机制之一。

苏姜猪新品种及其亲本对猪肺炎支原体感受性评价

通过临床症状、肺病变指数评价以及血清学方法对苏姜猪新品种核心育种场、扩繁场的苏姜猪群、姜曲海猪群进行了猪肺炎支原体感受性评价。结果显示,苏姜猪、姜曲海猪肺炎支原体的多发时期都集中在育成育肥期,其次是保育期,母猪阶段发病率最低;苏姜猪的平均肺病变指数低于姜曲海猪,并且苏姜猪的屠宰检测群中有57头猪只没有支原体肺炎特征性病变,姜曲海猪只有6头,苏姜猪对猪肺炎支原体的耐受性明显高于姜曲海猪。

仔猪水肿病病原菌的分离和鉴定

选择东北三省的锦州、丹东、盘锦、阜新地区自然发生仔猪水肿病的病例,共分离出96株仔猪水肿病大肠杆菌。对其中的12株菌进行生化鉴定、血清型鉴定和致病性检测。生化鉴定结果:12株菌均符合大肠埃希氏菌生化特征。血清型鉴定结果:12株菌分别为O139、O138、O141、054和048五种血清型,主要为O139、O138和O141三种血清型。致病性检测的结果:菌液、毒素对小白鼠攻毒,结果表明对小白鼠有较强的致病性,引起小白鼠死亡,剖检见相关器官水肿;菌液、毒素对猪攻毒试验结果表明感染断奶仔猪,各病变脏器均分离到大肠杆菌,各方面特性均与所攻毒菌株一致。

猪传染性胸膜肺炎的流行特点与防治措施

猪传染性胸膜肺炎是规模猪场常见细菌性呼吸道疾病的主要疫病之一,是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种接触性传染病,以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎为特征,临床表现为体温升高、咳喘、张口伸舌和腹式呼吸等,主要诱因为胸膜肺炎放线杆菌进入呼吸系统,造成呼吸系统损伤,使猪群出现病症并引发死亡。文章结合猪传染性胸膜肺炎的病原、流行特点,提出符合规模化猪场有效防控猪传染性胸膜肺炎的综合防治措施,以提高猪场对该病的防控水平。

猪链球菌和猪大肠杆菌对19种药物的敏感性分析

选取19种临床常用抗菌药物,采用纸片扩散法及试管二倍稀释法分别对猪链球菌和猪大肠杆菌韶关分离株进行药物敏感性分析,旨在为兽医临床用药提供参考。结果表明,猪链球菌和猪大肠杆菌对所选药物呈多重耐药,且耐药谱广。其中,猪链球菌对环丙沙星、呋喃妥因、菌必治、氨苄青霉素、青霉素G等高度敏感,对阿奇霉素、罗红霉素、先锋霉素Ⅴ、氯霉素、林可霉素耐药,耐药率为26.3%;猪大肠杆菌对先锋霉素Ⅴ、菌必治、阿米卡星、复达欣高度敏感,对罗红霉素、氨苄青霉素、青霉素G、羧苄青霉素、林可霉素、氯霉素和阿莫西林耐药,耐药率为36.8%。

河南地区鸡猪源大肠杆菌的耐药性监测

从河南中北部地区多个规模化鸡场和猪场采集病料，经大肠杆菌显色培养基鉴定，共分离保存157株鸡源大肠杆菌和92株猪源大肠杆菌，采用二倍肉汤稀释法对23种抗菌药物进行了药物敏感性测定。耐药性监测结果表明，鸡源大肠杆菌对阿莫西林／克拉维酸、头孢噻呋和阿米卡星相对较为敏感，耐药率分别为40．8％、59．9％和56．7％，对氨苄西林、卡那霉素、四环素、磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑、环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、洛美沙星、达氟沙星、多粘菌素E等高度耐药；猪源大肠杆菌对阿米卡星最为敏感，耐药率仅为2．0％，其次是阿莫西林／克拉维酸、头孢噻呋和安普霉素，耐药率分别为56．5％、60．9％和65．2％，对氨苄西林、头孢唑啉、链霉素、卡那霉素、大观霉素、四环素、氯霉素、环丙沙星、达氟沙星等则高度耐药。多数菌株普遍呈多重耐药，以17～23耐药株为主。这些数据为本地区的用药提供了参考，同时也显示本地区鸡、猪源大肠杆菌的耐药性极其严重，有必要对本地区进行细菌耐药性的跟踪监测。

仔猪痢清口服液治疗仔猪大肠杆菌病的临床试验

为了观察仔猪痢清口服液对仔猪大肠杆菌病的临床效果,对人工感染大肠杆菌的仔猪进行治疗性试验。用大肠杆菌O301对试验动物进行人工感染后,分为仔猪痢清低、中、高剂量治疗试验组进行观察。结果表明,仔猪痢清口服液治疗仔猪大肠杆菌病疗效可靠,效果明显。对人工感染引起的仔猪大肠杆菌病治愈率为90.0%,有效率达100%,并能显著降低仔猪的死亡率。

猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌多重PCR检测方法的建立和应用

根据已发表的猪呼吸道疾病主要致病菌猪链球菌（SS）、胸膜肺炎放线杆菌（APP）和副猪嗜血杆菌（HPS）基因序列合成3对特异性引物,通过单一PCR和三重PCR体系及条件优化,建立这3种致病菌的三重PCR检测方法,并对200份临床表观健康猪鼻拭子样品用三重PCR方法进行检测。结果显示：建立的三重PCR方法能对同一样品中的SS、APP、HPS 3种病原菌的DNA模板进行扩增,无交叉反应;对猪体内常见的猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪放线杆菌、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪沙门氏菌进行扩增,并无任何扩增产物;对SS、APP、HPS细菌纯培养物的检测敏感性分别为1×10^4CFU/ml、1×10^3CFU/ml、1×10^3CFU/ml;对人工模拟SS、APP、HPS感染组织样品的敏感性均为1×10^4CFU/ml。三重PCR方法对200份临床表观健康猪鼻拭子样品的检测结果显示：SS阳性160份,阳性率80.0%;APP阳性3份,阳性1.5%;HPS阳性45份,阳性22.5%。分别用细菌分离法和三重PCR法对30份临床病料进行检测,两者检测结果的符合率达到93%。建立的三重PCR可在4.5 h左右得到检测结果。

猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶基因缺失株的构建及其致病性

为了研究丝氨酸/苏氨酸磷激酶(STK)在猪链球菌致病过程中的作用,利用大肠杆菌-猪链球菌穿梭质粒p SET4s构建STK基因缺失株△stk。结果显示,stk基因缺失后,缺失株△stk易形成长链状结构;缺失株的半致死剂量(LD50)较亲本株高7倍,对CD1小鼠的致病能力降低;体内定植试验结果表明缺失株△stk在小鼠体内各器官的定植能力显著降低。这些数据表明STK与猪链球菌2型(SS2)的致病性相关。

猪链球菌病病原的分离鉴定及药敏试验

从新疆阿克苏地区某大型规模化养猪场和周边散养户处,采集疑似猪链球菌病的病料,进行触片染色、分离培养及生化鉴定试验;对鉴定为猪链球菌的菌株,采用琼脂纸片扩散法(K-B法)测定其对9种β-内酰胺类抗生素的敏感性。试验结果表明:从所采病料中分离鉴定出8株猪链球菌,分离鉴定的猪链球菌对β-内酰胺类抗生素敏感性整体上偏低,除青霉素G、氨苄西林的敏感率为50%外,其他均不超过50%。这为阿克苏地区猪场的猪链球菌病防治提供了参考。

抗猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV毒素单克隆抗体的制备及初步应用

据猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,App）apxⅣ毒素基因5′端的保守区域设计一对特异性引物,应用PCR方法扩增出致病性App1~12血清型菌株的保守5′端序列片段,构建的重组质粒pETapxⅣN经IPTG诱导表达出分子量大小为35.3kDa的可溶性重组蛋白。以亲和层析试剂盒纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗ApxⅣ毒素单克隆抗体（McAb）。以间接ELISA法筛选到两株分泌稳定、抗体亚类均为IgGl的杂交瘤细胞5B7和5C11,其培养上清和小鼠腹水抗体效价分别为1∶64、1∶128和1∶64 000、1∶128 000.两株单抗与临床猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪呼吸道繁殖障碍综合征病毒、猪黄、白痢产肠毒素大肠杆菌和猪肺疫多杀性巴氏杆菌感染阳性血清均不发生交叉反应,显示出良好的特异性.竞争性结合试验表明两株单抗识别不同的抗原结合表位.以（NH4）2SO4盐析法纯化的5C11小鼠腹水单抗包被酶标板,生物素标记纯化的5B7单抗建立了检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA法,其包被单抗最佳工作浓度为4μg/ml,生物素标记单抗最佳工作浓度为0.8μg/mL,对重组表达ApxⅣ毒素（rApxⅣ）的最低检出量为60pg/mL。从10份临床病猪血清样本中检出6份ApxⅣ毒素阳性,与细菌分离鉴定和PCR结果相符合,结果表明此法可用于App感染的临床诊断。

副猪嗜血杆菌河南分离株的优势血清型和毒力基因研究

为了解河南省副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)的血清型和毒力基因的流行与分布情况,对2017-2018年河南地区分离到的46株HPS,利用PCR反应鉴定血清型与毒力基因。结果显示,46株HPS共检测出7种血清型(2、4、5/12、6、7、11、13),血清型5/12和4为优势血清型,最流行的血清型为5/12型(15/46,32.6%),其次是4型(12/46,26.1%)和7型(7/46,15.2%)。强毒株和中等毒力株含有大多数毒力基因,无毒力菌株一般只含有vta1、ompP2、nanH和espP2基因。可见,毒力基因与血清型有很强的相关性。

13株仔猪黄痢病原菌的分离鉴定及致病基因的PCR检测

[目的]对从仔猪黄痢病死仔猪肝脏中分离的13株病原菌进行分离鉴定及其致病基因的PCR扩增,为该病的微生物学诊断及其病原的致病机理探讨提供参考资料。[方法]分别采集死于仔猪黄痢病仔猪肝组织,在麦康凯琼脂上进行病原菌的分离培养、革兰染色镜检、生化试验、DNA模板的制备、致病基因PCR扩增。[结果]从几个猪场采集的仔猪黄痢病死仔猪肝脏中分离到13株病原菌,其中一株为革兰阳性球菌,其余均为革兰阴性短杆菌,经PCR检测结果表明均为产肠毒素大肠杆菌并且均含有HPI^+。[结论]从上述结果可知,从发生仔猪黄痢猪场采集的病死仔猪肝脏中分离的13株病原菌一些为产肠毒素大肠杆菌并且均含有HPI^+,少数肠球菌也可引起仔猪黄痢。

猪源马链球菌兽疫亚种类 M蛋白原核表达及其小鼠免疫保护力分析

为了原核表达猪源马链球菌兽疫亚种去除信号肽的类M蛋白质,并分析该蛋白质对小鼠的免疫保护力,克隆了马链球菌兽疫亚种CY菌株去除信号肽的类M蛋白质基因Szp,并将Szp基因插入p ET28a表达载体,IPTG诱导,获得重组类M蛋白质,弗氏佐剂乳化重组类M蛋白质后,3次免疫小鼠,用同源菌株CY攻击。诱导获得分子量约5.8×104的重组蛋白质,免疫印迹结果表明该重组类M蛋白质能够被马链球菌兽疫亚种猪多抗识别。类M蛋白质免疫小鼠的存活率为60%,弗氏佐剂乳化灭活CY免疫小鼠的存活率为70%,PBS对照组小鼠攻毒后6 d内全部死亡。表达的类M蛋白质可以给予ICR小鼠部分的免疫保护力,保护效果略低于CY全菌灭活苗,提示可以对马链球菌兽疫亚种多种免疫保护性抗原进行联合,从而进一步提高对动物的免疫保护力。

猪链球菌2型Ⅲ型溶血素的研究

为了探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的Ⅲ型溶血素是否具有溶血活性以及Ⅲ型溶血素在SS2致病过程中的作用,本研究利用同源重组基因敲除法成功构建了SS205ZY的Ⅲ型溶血素(slyrp)基因缺失突变菌株Δslyrp及双基因缺失突变菌株Δsly/Δslyrp,并比较了野生菌株和基因缺失突变菌株的溶血能力以及对小鼠的致病力。结果表明,slyrp基因敲除后可导致SS2裂解红细胞的能力有所下降,而双基因缺失突变菌株Δsly/Δslyrp的溶血能力完全丧失;slyrp基因敲除后对小鼠的致病力没有影响。结果提示猪链球菌2型Ⅲ型溶血素具有一定的溶血能力,该Ⅲ型溶血素在SS2感染过程中,对溶血素(sly)起协同作用,不是SS2主要的毒力相关基因。

猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

已知多种动物均易被病原性大肠杆菌感染发生大肠杆菌病。在世界各地,大肠杆菌是猪群中很多疾病,包括新生仔猪腹泻、断奶仔猪腹泻、败血症、多发性浆膜炎、乳腺炎、尿路感染的一个重要原因。肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)是一组不同种类的大肠杆菌,不仅可正常定植于肠道,而且能侵入引起菌血症,并诱发败血症或局部肠道外感染,如脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎等[1]。临床上通常使用抗生素进行大肠杆菌病的治疗,但近年来随着抗生素的大量使用,多重耐药大肠杆菌菌株日益增多,给人和动物的安全带来了极大隐患;而ExPEC产生的抗生素耐药性明显高于其他菌群,50%以上的菌株为多重耐药,甚至许多菌株已演化成超级细菌,严重影响了选择有效的抗生素对该类细菌引起的疾病进行防治[2]。由于发病率、死亡率升高和体重降低的增加,以及治疗、疫苗和饲料添加剂的成本增加,ExPEC引起的猪大肠杆菌病导致的经济损失日益显著。

5型副猪嗜血杆菌河南分离株的毒力基因研究

为了探究豫北某猪场呼吸道疾病发病原因,通过PCR鉴定分离株血清型,检测了14个可能与致病力有关的毒力基因(lsgB、capD、vta1、vta2、vta3、wza、hhdA、hhdB、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP2),分析其与血清型可能存在的关系,并做了豚鼠致病性试验。结果显示,该分离株含有全部上述毒力基因,对豚鼠致病力强,为5型副猪嗜血杆菌强毒株。