猪免疫抑制病防制

1引起猪免疫抑制的疾病 引起猪免疫抑制的因素很多，疾病、营养不良、饲料霉变、滥用抗生素以及环境恶劣等因素都可造成猪的免疫功能受损或下降，其中的疾病因素，即免疫抑制病（包括猪附红细胞体病、猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪气喘病等）是抑制和破坏猪免疫系统的最大因素。

猪环状病毒2型的PCR检测方法的建立及应用

根据国外已发表的猪环状病毒 2型 (PCV 2 )的全基因组序列 ,设计一对 2型特异性引物 ,对可疑病料进行PCR扩增。将扩增产物连接到pMD 18 T载体上并克隆到大肠杆菌DH5α中 ,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,证明扩增出了PCV 2的目的片段。将测序结果与GenBank收录的PCV 2序列进行比较 ,发现同源性均在90 %以上。用该PCR方法在 43份可疑病料中检测到了 12份PCV 2阳性病料 。

用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌

为了快速诊断猪的传染性胸膜肺炎 ,试验设计合成了 1对引物 ,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌的PCR方法。猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅰ型菌血清 2、5、6、9、10型均能扩增出预期片段 ;大肠杆菌、猪痢疾蛇形螺旋体、多杀性巴氏杆菌、鸡葡萄球菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。用该方法检测了自猪肺脏分离的30个菌株 ,有 11株为阳性 ,19株为阴性。结果证实 。

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA方法的建立

本试验通过差速离心法和非线性蔗糖密度梯度离心法纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)。经三氯_三氟乙烷处理后 ,作为ELISA试验的标准抗原 ,并建立了检测PRRSV抗体ELISA方法。该方法与IFA、IPMA和国外同类商品化试剂盒进行了对比试验 ,表明该方法具有敏感性高、特异性好的特点 ,是一种快速准确检测PRRSV抗体的方法。间接ELISA方法在敏感性上要优于IFA和IPMA。

猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测

本研究应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性TaqMan探针,并以质粒作为阳性标准品,结合Corbett公司的RotorGene3000荧光定量PCR仪,建立了一种敏感、特异、重复性好的快速检测猪瘟病毒核酸载量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在10^8-10^1范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸,与本实验室建立的RT-套式PCR（RT-nPCR）具有相近的敏感性,二者对152份不同样品检测符合率达94.7%。应用本方法对人工感染10^6TCID50猪瘟石门强毒的猪只感染后0-14 d全血中猪瘟病毒RNA进行了定量检测,揭示了猪瘟病毒在猪体内复制的动态变化,证实了感染猪临床表现与病毒滴度存在明显的时间相关性。此外发现,在同居感染猪出现猪瘟临床症状前3-4 d可从其全血中检出病毒RNA。

猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用

根据流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)亚型基因序列间的差异性,分别设计H1、H3、H9、N1和N2的特异分型引物,并根据M基因设计A型流感病毒的通用引物。RT-PCR扩增猪流感病毒各亚型HA、NA和M基因的特异片段,克隆至pMD18-T构建重组质粒,制备探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。并对217份不同地区的样品进行检测。结果表明:该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒,并显示了较高的灵敏度和特异性,灵敏度比PCR高1个稀释度,比病毒分离高2个稀释度。该方法的建立为猪流感的检测及猪流感病毒各亚型在猪群中的流行病学调查提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。

反转录聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

本研究成功地建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的反转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术。根据PRRSV两个标准毒株 (美洲ATCCVR 2 332株及欧洲LV株 )膜蛋白和核衣壳蛋白的编码序列差异 ,自行设计合成了各自的引物 ,对两标准毒株及广州分离株 (CDG9512 )进行扩增 ,获得了预期长度约为 1kb的扩增片段。酶切鉴定 ,结果进一步证实两标准毒株间基因差异显著 ,分离株与美洲株更为接近 ,而不同于欧洲株。对猪伪狂犬病病毒、细小病毒、猪瘟病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒及空白对照进行扩增 ,结果均为阴性。该技术能检测到病毒达 10 2 .5TCID50的水平。表明RT PCR对PRRSV的检测不仅具有特异、敏感、快速诊断的优点 ,而且还可以对毒株的基因类型加以鉴别。在RT PCR技术检测PRRSV方法上也进行了改进与探讨。

通过猪毛检测丹麦长白猪氟烷基因的变异

采集５６头丹麦长白猪（其中１头为１周龄的仔猪、２６头种公猪、２９头种母猪）猪毛样品，粗提ＤＮＡ，进行ＰＣＲ扩增，得到６５９ｂｐ在氟烷基因中（即兰尼定受体基因）中第１８４３个碱基的特异片段，经过ＨｈａⅠ酶切和电泳来检测氟烷基因的变异，即其基因型。结果表明：（１）５６头长白猪中，阳性猪（ｎ／ｎ）１头占１·７９％，杂合子猪（Ｎ／ｎ）为１８头，占３２·１４％，阴性猪（Ｎ／Ｎ）为３７头，占６６·０７％。杂合子数实际值显著高于理论值，说明杂合子猪具有杂种优势，因而易被选作种用。Ｈａｌ￣N基因频率０．８２，Ｈａｌ￣ｎ的基因频率为０·１８。（２）每头猪采集２～４根含毛囊的毛样，就可进行ＰＣＲ扩增，采样方便且一次可大批量进行。（３）从１周龄仔猪开始至成年的种猪，均可用毛样进行基围诊断。

富镁蒙脱石与ORS治疗断奶仔猪腹泻的疗效观察

富镁蒙脱石治疗断奶仔猪腹泻综合症总有效率为 94.74% ,治愈率为 42 .1 1 %。氟哌酸治疗总有效率为6 6 6 7% ,治愈率 2 7.77%。蒙脱石辅以ORS治疗总有效率和治愈率分别提高至 95 .2 3%和 76 .1 9%。氟哌酸与ORS配合使用时 ,总有效率为 85 .0 0 % ,治愈率为 5 0 .0 0 %。氟哌酸治疗有效率显著低于蒙脱石治疗组 (P <0 .0 5 )。试验表明 ,蒙脱石是一种理想的治疗断奶仔猪腹泻的药物 ,ORS辅助治疗可显著提高治愈率。

广西猪流感血清学调查

采用血凝抑制试验对广西7个市30个猪场的2156份猪血清样品进行了猪流感病毒H1、H3亚型抗体的检测。结果显示,在被调查的30个猪场中,H1亚型抗体阳性率为96.67%,H3亚型抗体阳性率为86.67%,H1+H3亚型抗体阳性率为86.67%;在检测的2156份血清样品中,H1亚型抗体阳性率为29.04%,H3亚型抗体阳性率为31.54%,H1+H3亚型抗体阳性率为12.15%。表明在所调查的广西猪场中,猪流感病毒的感染较为普遍,大部分猪场都曾被H1、H3亚型感染。

猪瘟“免疫”猪群暴发猪瘟的诊断

1999年 1月至 3月武汉市某种猪场发生了以高热、高死亡率为特征的传染病。哺乳仔猪的发病率为6 6 .7% ,死亡率为 5 8.3 % ;断奶仔猪的发病率为 5 3.6 % ,死亡率为 12 .3 % ,造成巨大经济损失。经流行病学调查 ,病理变化观察和免疫荧光抗体检查 ,确诊该种猪场所暴发的传染病为猪瘟。此外 ,用间接血凝试验对 2 1日龄超前免疫仔猪的血清中猪瘟抗体水平进行了检测 ,结果表明仔猪的免疫合格率为 78.9%

实验猪卡氏肺孢子虫肺炎模型的建立及药物治疗试验

在住家及野外诱捕到 4只小家鼠、8只黄胸鼠和 5只褐家鼠 ,经皮下注射醋酸可的松 1 0周 ,建立了鼠类卡氏肺孢子虫 ( Pneumocystiscarinii,PC)肺炎模型。取模型鼠肺脏制成鼠 PC包囊接种物 ,给实验 组 8头猪经气管接种 3.2× 1 0 5个 PC包囊 ,且接种前 5d至接种后 4 2 d肌注醋酸可的松。给实验 组 8头猪经气管接种 6 .4× 1 0 5 个 PC包囊。接种后 ,实验 组猪均出现严重的临床症状 ,病理变化呈典型的 PC肺炎 ;实验 组猪均为亚临床症状。对实验 组猪再注射醋酸可的松后 ,出现了类似于实验 组猪的严重临床症状和病理变化。由此表明 ,实验猪免疫力低下时 ,接种外源性 PC可导致典型的 PC肺炎 ;健康实验猪接种外源性 PC,则呈隐性感染 ,经免疫抑制剂处理后可激活病原体 ,导致 PC肺炎。用氨苯砜 -联磺甲氧苄啶对 PC肺炎猪进行治疗试验 。

用重组核衣壳蛋白ELISA检测PRRSV抗体的研究

PRRSV重组N蛋白ELISA检测人工感染猪血清75份，与IDEXX公司ELISA试剂盒及IFA的符合率分别为973％和100％。检测疫苗免疫猪血清，阳性率100％，在免疫后6d就能检出抗体，比IFA敏感。检测85份我国田间猪血清，阳性率18．8％。

3种猪繁殖障碍性病毒Real-time PCR快速检测方法的建立

【目的】建立可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的多重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank数据库中PRV、PPV和PCV2的核苷酸序列,设计3对特异性引物和探针,以10倍系列稀释的阳性质粒为模板,优化反应条件,建立检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,并对其敏感性、重复性和特异性进行检验;分别采用单项和多重Real-time PCR方法,对临床收集的42份疑似病料进行检测,比较2种方法的符合率。【结果】特异性和灵敏度试验表明,建立的多重Real-time PCR检测方法具有高度特异性,与其他病原无明显交叉反应;检测灵敏度高,可检出1.0×101拷贝/μL的阳性质粒或1TCID50/mL的病毒样品。用多重Real-time PCR对42份临床疑似病料进行检测,其检测结果与单重Real-time PCR结果完全一致,表明多重Real-time PCR方法是可行的。【结论】建立了可同时检测PRV、PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法,该法具有快速、灵敏、特异和重复性好等优点。

用单克隆抗体PAP桥联酶标技术检测猪粪中的猪痢疾密螺旋体

用单克隆抗体(McAb)过氧化物酶—抗过氧化物酶(PAP)桥联酶标方法,在实验室检测8株猪痢疾密螺旋体(T.h)纯培养物,全部“+”,检测无害密螺旋体(T.i)及禽弧菌(AV)各1株全为“-”。用该法检测来自猪痢疾(SD)猪20头份全为“+”,健康猪39头份全为“-”和可疑猪场的猪粪201头份,其中38头份“+”,163头份“-”共260头份,其结果与McAb间接荧光抗体(IFA)试验一致。捎除了用多克隆抗血清(PcAS)IFA和结晶紫染色法对T.i及在健康猪群中所出现的假阳性。PAP法具有高度敏感性和特异性,且染色标本能长期保存。初步结果表明该法可以成为诊断工作和免疫学研究的有用工具。

链球菌群特异性IHA的建立和应用

采用链球菌C、D、E 和R 4 个血清群的参考菌株分别经十二烷基硫酸钠(SDS) 法制备群抗原致敏绵羊红细胞与相应的群特异性兔抗血清进行IHA 试验,均能发生特异性血凝反应,并有良好的重复性。血凝反应能够被致敏用的SDS抗原所抑制。IHA 试验中4 个血清群之间血清学反应与环状沉淀试验的结果一致。用以上两种方法对湖北省8 个疫区猪场共222 份血样群特异性抗体检测结果,二者总符合率为85 .78 % 。