禽腺病毒流行株FAdV-4-AH-F41的分子特征及对细胞因子的诱导作用

【目的】分析1株血清4型禽腺病毒(FAdV-4)流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水-肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞(LMH)对病原进行分离,采用PCR、透射电镜(TEM)观察和间接免疫荧光试验(IFA)对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体(SPF)鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸(cGAS)、干扰素刺激因子(STING)、白介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、干扰素-α(IFN-α)、IFN-β、干扰素调节因子7(IRF7)、线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70~90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列(43708 bp);遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30453-30674 bp,第2个发生在36884-36988 bp,第3个发生在43401-43715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照(DMEM/F12处理)相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中cGAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ-β差异达极显著水平(P<0.01),IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平(P<0.05),STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。

山东省肾型传染性支气管炎病毒地方株的生物学特性鉴定

禽传染性支气管炎病毒（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｂｒｏｎｃｈｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＩＢＶ）是冠状病毒科冠状病毒属的标准种，可引起鸡的传染性支气管炎（ＩＢ）。ＩＢ最早（１９３１）在美国发现，之后在世界各地均有此病的报道。传染性支气管炎有多种疾病类型，其中肾型传染...

禽流感病毒HA基因核酸疫苗脂质体制备方法的研究

用逆相法、冷冻溶融法、冻干法、脂膜法制得了禽流感病毒血凝素 (HA)基因重组质粒p SVH7DNA(核酸疫苗 )脂质体 ;用荧光法测得脂质体的包封率分别为 (15.58± 1.55) % ,(14.7±0 .79) % ,(11.4 3± 1.76 ) % ,(6 .0 8± 0 .35) % ,当在磷脂成分中加入阳离子脂时 ,脂质体的包封率分别为 (70 .4 1± 6 .4 9) % ,(57.58± 0 .88) % ,(53.72± 9.0 7) %和 (4 6 .56± 1.92 ) %。电镜观察发现四种方法所得的脂质体为单室和多室球形脂体混合物 ,其粒径大小分别为 16 3nm,189nm,138nm和2 35nm,结果表明逆相法、冻干法、冷冻溶融法为制备脂质体的有效方法。

禽霍乱的免疫预防

本文就禽霍乱病原的抗原结构、血清型及其与免疫保护间的关系 ;禽霍乱的免疫防治概况 ;禽霍乱疫苗的研究动态等进行评述 。

传染性法氏囊病、新城疫双联卵黄抗体冻干制剂的初步研制及应用效果

ＩＢＤ－ＮＤ双联冻干抗体稀释后必须符合合格标准，ＩＢＤ为ＡＧＰ价＝ １∶３２，ＮＤ为ＨＩ价＝ １∶５１２。实验室治疗有效率ＩＢＤ为７０％ ～９０％ ，ＮＤ为６０％ ～８０％ 。现地治疗有效率为８０．４７％ ，预防保护率为９６．８％ 。双联冻干抗体在４～８℃保存１ａ，其ＩＢＤ效价无变化，ＮＤ略有下降。此种双联冻干抗体与粗制卵黄抗体相比，无临床应用时传播疫病的危险性，确保使用安全高效。

禽大肠杆菌的药物敏感性试验

采用纸片法 ,测定分离自江苏不同地区的 35株禽大肠杆菌对 2 5种抗菌药物的敏感性。结果得知 ,对妥布霉素、利福平、丁胺卡那霉素、卡那霉素、新霉素敏感的菌株分别占 94.3%、91 .7%、91 .4%、71 .4%、71 .4%,其中高敏以上菌株分别占 1 7.1 %、1 6.7%、45.7%、31 .4%、8.6%,同一血清型的不同分离株药敏试验结果并不相同 。

我国部分地区NDV的分子流行病学研究

本研究根据新城疫病毒 (NDV)F基因编码区 1_374位核苷酸序列计算其遗传距离并绘制了NDV的系统发育进化树 ,将 6 8株NDV分为 9个基因型 (30株为国内分离株 ) ,其中Ⅰ～Ⅵ是早已存在的老基因型 ,Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ为新发现的基因型 ,特别是Ⅸ为我国特有的基因型 (F48E9、M3、HLJ_3、HeB_1P和NM_5 )。 1997～ 1999年在我国云南、广西、甘肃、陕西、新疆等地分离的YN_1P、GX_3、H1、H2、P1、GX_1、GX_2、GS_2、GS_3、SHX_2、SHX_3、SHX_6、SHX_7、XJ_2和 1991年分离的HuB_1均属于Ⅶ基因型 ,该基因型的病毒是 90年代以来引起新城疫发生的主要病原。根据遗传距离和分离年代可将此基因型进一步划分为 5个基因亚型 ,分别是Ⅶa、Ⅶb、Ⅶc、Ⅶd和Ⅶe。此外HuN_1/ 98、HLJ_4/ 95和HeH_1P属一个老的基因Ⅵ ,1979～ 1985年分离自青海的QH_1、QH_2、QH_4属于一个新的基因型—Ⅷ型。可见在我国新城疫的流行是极其复杂的 ,既有老基因型的危险 (Ⅰ～Ⅵ ) ,又有新基因型 (Ⅶ )的流行 ,更有我国独特Ⅷ和Ⅸ基因型潜伏。

我国部分地区H9亚型禽流感病毒血凝素基因序列比较与遗传发生关系分析

为从分子水平掌握我国H9亚型AIV的遗传变异情况和流行规律 ,本研究汇集近年来从我国 1 2个省、市、自治区的发病鸡群中分离到的 2 3株H9亚型禽流感病毒 ,通过RT -PCR方法和核苷酸序列测定获得了 2 3个毒株的HA基因cDNA核苷酸序列。核苷酸和推导的氨基酸序列同源性比较结果表明 ,这些毒株HA基因的核苷酸序列同源性为 94.1 %～1 0 0 % ,氨基酸序列同源性为 95 .4%～ 1 0 0 % ;将这 2 3个毒株和来自亚洲及世界其它地区的另外 3 1株的HA基因cDNA序列同源性进行比较发现 ,分离自香港的HK1 70 4 99株与日本的 2个毒株关系较近 ;氨基酸序列分析发现 ,CKGS1 99、CKTJ1 96、CKTJ2 96、CKSH3 0 0和CKBJ1 97五个毒株各发生了一个潜在的糖基化位点的丢失。 5 4株H9亚型AIVHA基因 5 5bp～ 1 1 5 2bp的氨基酸序列分析发现 ,裂解位点尽管有 1 0种基序 ,但本研究中的 2 3株和近年来从我国大陆和香港地区的分离的毒株则均为RSSR↓GLF ;构成受体结合位点的 1 91位氨基酸有一个规律 ,即所有中国大陆毒株与部分香港毒株都为N ,其它毒株均为H ,1 41aa～ 1 43aa处的糖基化位点有与 1 91aa类似的规律 ,即 :凡是 1 91aa为N的毒株 ,该处均为NVS(CKBJ1 94除外 ) ,凡是1 91aa为H的毒株 ,则该处均为NVT ;遗传发生关系分析 ,中国大陆?

鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒的研制及其应用

建立了快速鉴别诊断鸡肿瘤病的PCR技术 ,研制鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒。应用该试剂盒在两年多时间里 ,对来源于广西养鸡业发达地区的 13 9个鸡群共 5 0 5只病、死鸡的 15 70份肿瘤及可疑肿瘤组织病料进行了检测 ,马立克氏病、网状内皮增生症和禽白血病的阳性率分别为 74.0 6%、11.49%和 6.73 % ,肿瘤病的混合发生率为 16.83 %。结果表明 ,应用PCR技术建立的鸡肿瘤病快速鉴别诊断试剂盒具有操作简便快捷、结果准确可靠、保存方便等特点 ,不仅适用于临床肿瘤病的鉴别诊断 。

禽流感病毒血凝素基因的克隆及其DNA疫苗的免疫原性

禽流感病毒（ＡＩＶ）的表面结构蛋白血凝素（ＨＡ）是其主要保护性抗原。本研究参考已发表的Ｈ７亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因序列，设计合成了１对Ｈ７ＨＡ特异引物，以ＡＩＶＡ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ－Ｑ／９８３／７９／（Ｈ７Ｎ１）（Ａ／Ａｆｒｉ．Ｓｔａｒ．／Ｅｎｇ）核酸为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出１条１．７ｋｂｃＤＮＡ片段。将这一片段定向克隆到ｐＵＣ１８中，对其５′端及３′端部分序列测定后，确证其为ＨＡｃＤＮＡ。将ＨＡ基因置于ＳＶ４０启动子和增强子下游，构建了这一基因的真核表达质粒ｐＳＶＨ７。以此质粒１００μｇ肌肉注射免疫３周龄ＳＰＦ鸡６只，４周后以１００倍鸡胚感染剂量（ＥＩＤ）的ＨＡ基因同源病毒对所有鸡进行攻毒，１周后以棉拭子进行泄殖腔病毒分离；免疫后１～６周每周对所有鸡翅静脉采血，分离血清，检测ＨＩ抗体。结果，１００μｇ免疫组鸡病毒分离数为０／６，对照组为６／６；攻毒后１周免疫组鸡ＨＩ效价为１∶３２～１∶６４，对照组为１∶４～１∶１６。表明所构建的ＨＡ基因表达质粒可作为基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应。

禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究

用表达禽流感病毒 (AIV)核蛋白基因的杆状病毒感染Sf9昆虫细胞 ,以其表达产物制备抗原 ,建立了以杆状病毒系统表达的AIV核蛋白为抗原的禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术 (rNP_ELISA)。其抗原最适包被量为 0 .6 μg/孔 ,待检血清最适稀释度为 1:2 0 0 ,酶标抗体使用浓度为 1:10 0 0。根据对 140份SPF鸡血清检测结果的统计分析 ,确定其判定标准为OD值大于 0 .15的血清样品为阳性。用rNP_ELISA检测 15 0份SPF鸡血清、194份非免疫鸡血清及 30份其它 15种鸡疫病阳性血清均为阴性 ;检测A型AIV15个不同亚型 (H1～H15 )毒株的特异性血清均为阳性 ;对人工接种AIV的SPF鸡第 3天即能检出抗体 ,到第 16 2天试验结束时检测仍为阳性。其批内和批间重复试验的变异系数分别在 2 .9%～ 7.2 %和 3 .4%～ 9.8%之间。对3138份鸡血清进行监测 ,rNP_ELISA与全病毒间接ELISA(AIV_ELISA)、琼脂扩散试验 (AGP)及血凝抑制试验 (HI)的符合率分别为 99.9%、97.1%、98.8% ;并能 10 0 %检出AGP阳性及疑似、HI阳性的血清样品。试验证明 ,rNP_ELISA是检测A型禽流感病毒血清特异性抗体的一种特异、敏感、微量、快速。

鹅源禽副粘病毒GPMV/QY97-1株的生物学特性

对新近分离到的鹅源禽副粘病毒 GPMV/QY97-1株的生物学特性进行了研究。结果表明 ,该病毒粒子在电镜下呈球形 ,直径 1 2 1～ 2 50 nm,表面有纤突 ,能凝集鸡的红细胞 ,血凝反应能被 I型禽副粘病毒阳性血清所抑制 ,由此初步判定该病毒属于 I型禽副粘病毒。该病毒人工感染 1、1 4、2 8、4 8日龄的鹅 ,发病率均为1 0 0 %,致死率分别为 1 0 0 %、87.5%、62 .5%、1 2 .5%;人工感染 2 5日龄的鸡 ,发病率和致死率均为 1 0 0 %;

湖北省禽流感的诊断及病毒株的分离与初步鉴定

通过采用琼脂扩散法 (AGP)对湖北省 8个发病鸡场进行禽流感抗体的检测 ,证实了禽流感的存在。从某鸡场 5只濒死鸡气管刮屑及内脏材料中分离到了一株病毒。应用HI试验和电镜负染技术确证该分离物为A型流感病毒 ,其血凝价可达 1∶2 5 6 0。该病毒粒子有囊膜 ,呈球形或椭圆形 ,大小为 80～ 12 0nm ,其血清型为H9N2

不同血清型禽霍乱巴氏杆菌免疫的研究Ⅰ.不同方法制备免疫原的免疫保护试验

应用禽多杀性巴氏杆菌C48- 1菌株 (血清型为A∶1 ) ,分别通过接种人工培养基、含动物血液人工培养基、发育禽胚、感染易感鸡等途径 ,获得相应菌培养物后 ,分别制备成灭活免疫原 ,进行了对鸡免疫接种后的感染保护试验。结果初步表明 ,应用接种发育禽胚及感染鸡制备的相应菌培养物 ,其菌体发育及制备免疫原后免疫接种鸡的感染保护效果 ,均优于人工培养基的相应培养物 。

不同血清型禽霍乱巴氏杆菌免疫的研究Ⅱ.免疫制剂的制备与检验

在试验研究基础上 ,应用发育鸡胚培养的禽多杀性巴氏杆菌 ,制备相应的灭活免疫原 ,加入油乳剂免疫增强剂 ,制备了相应的免疫制剂。通过对鸡做免疫接种后的感染保护试验 ,初步表明具有较好的免疫保护效果 ,从而为控制禽霍乱的发生与流行 。