鸡肾型IBV地方分离株N基因的克隆及分子遗传变异分析

用RT-PCR方法对分离于陕西省不同地区的8个鸡肾型IBV毒株的Ⅳ基因分别进行了扩增,将各扩增产物与T载体连接后,转化感受态细胞筛选阳性克隆质粒并进行基因测序,用DNAstar软件将这8个毒株与GenBank收录的7个IBV代表毒株的Ⅳ基因进行了比较分析,研究了其变异情况。结果表明,B01,YL,WH和 YX株与7株代表毒株的同源性较高,而G,BJ,WG,FF株与7个代表毒株的同源性相对较低。氨基酸推导序列比对结果表明,N蛋白突变以散在的点突变形式为主,其中46,48,50,75,78,189,232,236,237,299,301,350,366等位点容易发生突变,突变位点无明显规律性。

IBV陕西分离株M基因的克隆与遗传变异分析

为了研究IBV陕西分离株M基因的遗传变异情况及分子特征，参照NCBI所登录的IBVM基因序列设计了1对引物，应用RT-PCR方法对陕西8株IBV分离株的M基因进行扩增，并构建克隆载体，对阳性质粒测序后进行核苷酸序列及氨基酸序列同源性和进化发生关系分析，并对M蛋白的二级结构和跨膜区进行预测。结果表明，8个IBV分离株间的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸同源性分别为92．3％～99．8％和95．4％～100％，分离毒株与参考毒株的M基因核苷酸和M蛋白氨基酸序列同源性分别为87．4％～99．5％和89．4％～99．5％；分离毒株与参考毒株M蛋白的α-螺旋结构主要分布在N端前100氨基酸肽段区，其他的部分主要是哥折叠和无规则卷曲结构；分离毒株的M蛋白均包含有3个跨膜区。表明IBV分离株M蛋白在基因序列和二级结构上相对保守。

鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株HLJ-0504 VP5基因缺失株感染性克隆的构建及鉴定

利用体外定点突变技术,缺失vvIBDV HLJ-0504株VP5基因,通过多重PCR在基因组两端分别引入锤头状核酶序列(HamRz)和丁肝病毒核酶序列(HdvRz)。将带有核酶序列的IBDV基因组插入载体pCAGGs的β肌动蛋白启动子下游,构建了IBDV感染性克隆pCAGGHLJ0504A△ VP5HRT,将该感染性克隆与pCAGGHLJ0504BHRT共转染DF-I细胞。IFA,RT-PCR,电镜观察均显示获得重组病毒,将其命名为rHLJ0504HT△VP5。vvIBDV VP5基因缺失感染性克隆的成功构建为我们利用反向遗传操作技术快速致弱vvIBDV,构建IBD的候选疫苗株奠定了基础。