4株鹅源新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及序列分析

测定了 4株鹅源新城疫病毒 (NDV)融合蛋白 (F)基因 5’端 1 70 0核苷酸片段的序列 ,并由此推导了F蛋白氨基酸序列 ,并对鹅源NDV的基因型分类地位进行探讨。结果表明 ,4株病毒F基因的同源性大于 97% ,与DNV标准强毒株F48E8F基因的同源性为 86 0 %～86 8% ,F基因转录起始序列及起始密码子位置与已知NDV完全相同 ;F蛋白具有和已知NDV相似的各种功能区 ,F蛋白前体F0裂解位点附近的氨基酸序列为112 RRQKRF117,符合NDV强毒株的特征。对F基因第 3 3 4～ 1 6 82位核苷酸之间 3种限制性内切酶HinfⅠ、BstoⅠ、RsaⅠ酶切图谱的分析表明 。

鹅源禽副粘病毒NA-1株生物学特性的研究

对从吉林省分离的鹅副粘病毒NA-1株应用SPF鸡胚进行传代,通过电镜形态学观察、HA及HI试验、血清学鉴定、毒力鉴定、AGID试验、血凝谱的测定、动物感染试验等一系列研究,发现NA-1株属于禽副粘病毒Ⅰ型,具有新城疫病毒速发型相似的毒力,属于强毒力毒株,遗传进化树分析属于基因Ⅶ新城疫病毒。该病毒对鹅、鸡均具有高致病性。

一株鹅细小病毒全基因特征分析

根据GenBank登录的鹅细小病毒基因序列和基因组结构特征，采用PCR技术扩增获得一株鹅细小病毒株（Goose parvovirus，GoPV）全基因序列，为中国大陆地区首次报道。GoPV株病毒全基因大小为5106nt，其基因组5’端和3’端均含有相同的末端倒置重复序列（inverted terminal repeats, ITR），ITR全长为444nt。GoPV基因组主要由左右两侧两个开放阅读框组成，左侧编码非结构蛋白（non-structureprotein，NS）NSl和NS2，右侧编码3种结构蛋白（viral structural protein，VP）VP1、VP2和VP3。NS基因全长为1884nt（537-2420nt），其中NS2全长1356nt（1065～2420nt）；VP基因全长2199nt（2439-4637nt），其中Ⅵ叼全长1764nt（2874-4637nt），VP3全长1605nt（3033-4637nt），在其右侧的ITR前有一个Poly（A）的尾。GoPV株病毒全基因和欧洲疫苗株（EU583392（VG32／1，Europe））核苷酸同源性最高，高达98．6％。本研究为进一步研究GPV分类地位以及进化关系提供依据，也为研究GPV强毒株和疫苗株之间生物学特性以及GPV治病机理和开发基因工程疫苗奠定基础。

朗德鹅圆环病毒全基因组序列测定和遗传演化分析

圆环病毒可以引起免疫抑制,从而造成其他病原的并发和(或)继发感染。为研究鹅圆环病毒(Goosecircovirus,GoCV)全基因组的分子生物学特性,运用重叠PCR技术从江西朗德鹅组织脏器提取的DNA中扩增出2条核苷酸序列,用Lasergene v7.1 DNAStar软件对拼接后的鹅圆环病毒江西株核苷酸组成、基因组结构及病毒的遗传变异进行分析。结果表明,所获病毒(简称GoCV-JX1)核酸全基因大小1821 nt,与GenBank登录的浙江永康株(No.DQ192280)GoCV的核苷酸同源性最高,高达98.6%。GoCV-JX1为我国江西朗德鹅群中首次报道并被测定全基因的鹅圆环病毒。

鹅细小病毒基因组结构特征研究进展

鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)属细小病毒科,细小病毒属,由我国学者方定一1956年首次分离报道。GPV基因组约5 Kb,由左右2个完整的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成:LORF(left ORF)和RORF(right ORF)。LORF编码非结构蛋白(nonstructural protein,NS)NS1和NS2,RORF编码VP1、VP2和VP3三种结构蛋白。本文针对近年来鹅细小病毒基因组结构特征的研究进展进行了综述。

小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定

为了建立快速、简便的番鸭小鹅瘟病诊断方法,用纯化的小鹅瘟病毒(Goose parpovirus,GPV-PT)免疫BABL/c鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA和间接免疫荧光检检(indirect immunofluorescence assay,IFA)筛选,获得3株能稳定分泌抗GPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(分别命名为D11、7-7和E16)。三株单抗的免疫球蛋白亚类分别为IgM、IgG3和IgM,3株单抗均具有ELISA、IFA和中和特性;其中两株(D11和E16)具有致敏胶乳特性;特异性测定显示3株单抗仅与GPV反应,而与番鸭细小病毒(Duck parpovirus,MPV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)、鸭副粘病毒(Paramyxovirus,PMV)、鸭肝炎病毒(Duck hepatis virus,DHV)、正常细胞和胚液等均无交叉反应;在-20℃保存期为18个月。结果表明3株单抗均具有良好的特异性,为研制免疫学快速诊断奠定了基础。

密码子优化型鹅细小病毒病毒样颗粒的表达与鉴定

根据昆虫细胞密码子的偏嗜性,对鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP2基因的密码子进行优化,利用Bac-to-Bac表达系统构建了表达优化VP2基因的重组杆状病毒,通过感染昆虫细胞(Sf9)获得病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。SDS-PAGE分析显示Sf9细胞中出现了65 kDa的蛋白条带,间接免疫荧光(indirect immunofluorescent assay,IFA)和Western blot结果均证实表达产物能与鼠抗GPV VP2抗体发生特异性反应,说明其具有良好的免疫反应性。同时,试验结果还证明,密码子优化后的GPV VP2基因在昆虫细胞中表达量得到了提高,明显高于野生型VP2基因。透射电镜观察纯化后的昆虫细胞表达产物,可见直径约30 nm的VLPs,表明密码子的优化并不影响VP2蛋白的组装。本研究为进一步研制诊断抗原以及新型GPV疫苗等奠定了基础。

鹅星状病毒衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的制备和鉴定

采用RT-PCR扩增获得鹅星状病毒(Goose astrovirus)的衣壳纤突蛋白基因vp27,并将其克隆至pCold-SUMO原核表达载体。重组表达载体pCold-vp27经过测序和双酶切验证正确后,转化到感受态细胞Rosetta。挑取阳性克隆子,利用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达鹅星状病毒衣壳纤突重组蛋白,使用镍柱纯化衣壳纤突蛋白VP27,将定量的重组蛋白免疫BALB/c小鼠。利用ELISA、Western blot和IFA鉴定鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体。结果显示,鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的效价大于1∶64000,Western blot试验结果证明了鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体的特异性,IFA试验结果证明鼠抗衣壳纤突蛋白VP27多克隆抗体能够识别天然的鹅星状病毒衣壳纤突蛋白VP27。

抗鹅细小病毒单克隆抗体的制备及其免疫荧光检测方法的建立

为建立免疫荧光检测鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)的方法,本研究利用超速离心纯化的GPV作为免疫原,制备了3株抗GPV特异性单克隆抗体,依次命名为GPV-Mab-6C8、GPV-Mab-1B9、GPV-Mab-2H8。试验结果表明,3株抗GPV抗体特异性良好,并能够中和GPV对鹅胚成纤维细胞的感染能力。利用抗GPV单抗作为一抗,FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗,建立了检测GPV的间接免疫荧光方法(indirect immunofluorescence assay,IFA),该方法不仅能够检测鹅胚成纤维细胞中的GPV,还能够检测发病鹅组织冰冻切片中的GPV。本研究制备的抗GPV特异性单克隆抗体和建立的检测GPV的免疫荧光方法,为今后GPV细胞活疫苗的检测评价和临床诊断提供了技术手段。