甘氨酸对小鼠完整卵巢组织玻璃化冷冻的影响

本实验旨在探究与传统冷冻液相比,昆明小鼠完整卵巢组织玻璃化冷冻液中添加甘氨酸对组织内卵母细胞解冻后细胞形态、组织内凋亡基因表达的影响。选用15只7~8周龄雌性昆明小鼠,取卵巢分为3组,即冷冻液组、血清+冷冻液组、甘氨酸+冷冻液组(在冷冻液、解冻液中添加甘氨酸使其终浓度为1 mmol/L),每组10个卵巢。对解冻后卵巢组织分别体外恢复3 h以及体外培养4 d,采用western blot法检测各组凋亡蛋白(cleaved-caspase 3、Bcl-2、Bax)表达情况以及荧光定量PCR检测凋亡相关mRNA(GAPDH、Bcl-2、Bax)的表达情况。结果表明:甘氨酸+冷冻液组解冻体外恢复3 h后卵母细胞形态正常率高于冷冻液组(P<0.05),也高于血清+冷冻液组但差异不显著;甘氨酸+冷冻液组的cleaved-caspase 3表达情况低于其他2组(P<0.05),Bcl-2/Bax凋亡蛋白表达水平高于其他2组(P<0.05);甘氨酸+冷冻液组GAPDH基因相对表达量高于其他2组(P<0.05)。甘氨酸+冷冻液组Bcl-2/Bax基因比值高于血清+冷冻液组、冷冻液组(P<0.05)。结果表明,添加1 mmol/L甘氨酸可以保护解冻后卵母细胞的形态结构以及抑制卵巢组织内细胞凋亡水平。

TALEN介导的foxo3a敲除小鼠的表型分析

为了探究foxo3a基因对小鼠繁殖力的影响,本实验统计了TALEN-foxo3a编辑小鼠后代的阳性率以及繁殖率。共统计foxo3a^(-/+)小鼠和WT小鼠正反交后代4窝,总产仔数36只,其中单敲阳性数为13只,单敲阳性率为36.11%,阳性率基本符合孟德尔遗传定率;foxo3a^(-/+)小鼠自交后代共统计8窝,总产仔数61只,其中单敲阳性数为34只,单敲阳性率为55.74%,双敲阳性数为12只,双敲阳性率为19.67%,总阳性率为75.41%,阳性率也符合孟德尔遗传定率。选择鉴定出foxo3a^(-/-)母鼠,对其产仔数进行统计,共统计4窝,平均产仔数为7只,显著低于野生小鼠9.71只(P<0.05)。foxo3a^(-/+)母鼠产仔数共统计13窝,平均产仔数为7.38只,亦显著低于WT小鼠(P<0.05)。foxo3a^(-/+)小鼠和WT小鼠交配共统计产仔数8窝,平均产仔数为7.88只。foxo3a^(-/-)小鼠和foxo3a^(-/+)小鼠产仔数差异不显著(P>0.05)。QRT-PCR结果表明:foxo3a基因在foxo3a^(-/+)小鼠卵巢内表达量显著下降,但是foxo3a基因在foxo3a^(-/+)小鼠和WT小鼠睾丸组织内表达量无明显差异;foxo3a在foxo3a^(-/-)小鼠卵巢内表达量下降,在睾丸内的表达量却上升,揭示了foxo3a能够影响小鼠的繁殖力。本研究为阐明foxo3a参与哺乳动物繁殖效率的分子机制研究奠定了基础。