CSBV的分离鉴定及其感染幼虫后的应答反应

本研究旨在为了解江西某蜂场蜜蜂是否感染中蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)并探究CSBV感染中蜂幼虫后的应答反应。采集该蜂场疑似感染CSBV的蜜蜂,采用RT-PCR的方法检测CSBV核酸,取阳性的蜜蜂样品进行病毒分离纯化、电镜观察及测序。将纯化鉴定后的CSBV对3日龄的中蜂幼虫进行人工感染,进行转录组测序,分析中蜂幼虫感染CSBV的应答反应。通过RT-PCR验证和电镜观察成功鉴定CSBV,并命名为CSBV-JX。CSBV-JX电镜观察直径为25~30 nm。对其进行分段扩增测序,发现基因组序列为8781 bp,对其进行系统发育分析,表明东方蜜蜂的SBV(AcSBV)与西方蜜蜂的SBV(AmSBV)明显分为两个分支,具有较强的地域分化性。转录组测序分析发现,中蜂幼虫在感染CSBV-JX后2 h有59个基因上调表达,83个基因下调表达;感染后12 h有68个基因上调表达,86个基因下调表达。本研究成功分离鉴定一株中蜂囊状幼虫病毒并命名为CSBV-JX。同时对CSBV-JX感染中蜂幼虫的转录组学分析发现,CSBV-JX感染2 h和12 h引起宿主的响应较小,这可能是CSBV-JX感染的2 h和12 h为病毒增殖的早期阶段病毒载量低,引起的宿主免疫响应小所导致。在CSBV-JX感染中蜂幼虫的2 h和12 h期间引起的差异基因与代谢通路关联较大,研究结果为阐明解析CSBV感染中蜂的分子机制提供了基础。

中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析

【目的】系统鉴定和分析中华蜜蜂(Apis cerana cerana)吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本,为深入开展相关基因和剪接体的功能研究奠定基础。【方法】基于前期已获得的高质量中华蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将全长转录本比对Nr数据库筛选出吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本。利用gffcompare软件将全长转录本与东方蜜蜂(Apis cerana)参考基因组上注释的转录本进行比较,鉴定未注释的新基因和新转录本。利用TAPIS pipeline预测和分析吞噬与包囊作用相关基因的可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)位点,并通过TBtools软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。使用Astalavista软件鉴定可变剪接(alternative splicing, AS)事件,并通过IGV浏览器进行结构可视化。通过RT-PCR验证AS事件的真实性。【结果】共鉴定到中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关的基因66个和全长转录本395条,发掘出东方蜜蜂参考基因组未注释的2个新基因和303条新转录本。对参考基因组已注释的34个基因进行了结构优化,分别延伸了18个基因的5′端和12个基因的3′端,同时延长了4个基因的5′端和3′端。共鉴定到含有1个及以上APA位点的吞噬与包囊作用相关基因47个,其中多于5个APA位点的基因最多,为32个。在APA位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为:GRBGCNKSDAACAAYTRBGCBMRNGGBYAYTAYWCNVWNGG。共鉴定到吞噬与包囊作用相关基因的AS事件296次,其中包括131次可变3′端剪接(alternative 3′splice site, A3SS)、85次内含子保留(intron retention, IR)、70次可变5′端剪接(alternative 5′splice site, A5SS)和10次外显子跳跃(exon skipping, ES)。RT-PCR结果显示,扩增的目的片段大小符合预期,证实了随机选择的2次AS事件的真实性。【结论】系统鉴定了中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本以及AS事件和APA位点,优化了东方蜜蜂参考基因组注释的吞噬与包囊作用相关基因的结构。

一种新的蜜蜂细菌性幼虫病病原的分离鉴定

2005年早春,在浙江部分地区出现了一种严重的蜜蜂细菌性幼虫病,该病导致蜜蜂幼虫颜色发黄,失去光泽;严重时幼虫死亡腐烂。从10批发病死亡幼虫样品中,分离得到并保存了5类纯培养物。通过蜂群接种试验和实验室人工培养的幼虫接种,确定L2菌株能引起与自然发病相似的症状,且能从接种发病的幼虫上再次分离到相同菌株,证明L2菌株是该蜜蜂细菌性幼虫病的致病菌。进一步对分离到的该致病菌从发病特征、病原形态学、生理生化特性、16SrRNA序列等方面进行了分析鉴定,结果显示:该菌株属于肠球菌属的屎肠球菌(Enterococcusfaecium),不是目前报道的任何一种已知蜜蜂细菌性幼虫病的病原。

中蜂囊状幼虫病病毒检测及地区间遗传变异

为了摸清云南蒙自地区整个中蜂场春繁季节中蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)的感染及其病毒株分化情况。运用RT-PCR对57群滇南中蜂进行CSBV带毒率检测和遗传变异分析。结果表明:该蜂场有26群滇南中蜂感染CSBV,感染率为45.6%,其中隐性感染为31.57%,显性感染为14.04%。所选用的2对引物均能较好地对滇南中蜂CSBV进行分子识别鉴定,其中第二对引物更适合;种群间RNA序列变异分析表明:云南种群与重庆种群聚为一个分支,遗传距离为0.014。说明春繁季节是云南蒙自地区滇南中蜂CSBV发生的重要时段,应提早采取预防措施;CSBV病毒株在不同地区存在分化现象,云南种群与重庆种群遗传关系较近,推测CSBV地理距离与遗传距离可能有关系。

浙江省淳安县中华蜜蜂囊状幼虫病毒与蜂房球菌感染情况调查

为了解浙江省淳安县中华蜜蜂囊状幼虫病和欧洲幼虫腐臭病病原[中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)和蜂房球菌(Melissococcus pluton)]全年流行情况,于2019年1月—12月采集淳安县5个饲养点的中蜂工蜂,并采用聚合酶链式反应检测方法,监测这2种病原在蜂群内的动态变化情况。结果显示:CSBV蜂群感染率在春季3月最高,为84%,到夏季7月降到最低,又从秋季开始升高,一直延续到冬季;蜂房球菌感染率从春季开始升高,到夏季开始下降,又从秋季开始升高,在10月和11月达到全年最高水平,为72%,冬季略有下降;在一年当中,蜂群内中蜂囊状幼虫病和欧洲幼虫腐臭病病原具有共同存在的现象;通过实时荧光定量聚合酶链式反应检测发现,秋季蜂房球菌存在的蜂群内CSBV载量显著高于单一检出CSBV的蜂群(P<0.05)。总之,本研究明确了浙江省淳安县中蜂2种主要病原在蜂群中的全年流行动态情况,可为该地区中蜂病害的预防和控制提供理论指导。

蜜蜂传染性疾病的实验室诊断技术

蜜蜂传染性疾病都具有一定的潜伏期或隐性感染,只有在一定条件下才表现出症状,一旦内外环境适应病原的生存和发展,便会引起病害的流行。本文主要对蜜蜂传染性病原的体外培养镜检、免疫学及分子生物学的实验室诊断方法及最新研究进展、发展趋势等进行综述。

中蜂囊状幼虫病的诊断与防治细节

一、中蜂囊状幼虫病流行特点中蜂囊状幼虫病是由蜜蜂囊状幼虫病毒引起的疾病,中蜂对该病毒抵抗力较差,感染后往往会引发病症,蜂群由强群变弱群,不但严重影响生产性能,还会造成蜂群断子飞逃。中囊病属病毒性疾病,抗生素治疗效果差,病程反复易传播,春夏秋季均可发生,以春末夏初和秋末冬初较为多发。一旦蜂群发生中囊病,如果不采取有效措施,极易造成全场及周边地区的流行。

蜜蜂病毒性疾病的综合预防措施

蜜蜂和自然界其它生物一样,都会受到病原微生物的侵袭,感染各种各样的疾病.其中包括蜜蜂病毒性疾病.侵袭蜜蜂的病毒大都属于肠道病毒属和虹彩病毒属的病毒.蜜蜂感染这些致病性病毒后,使幼虫和成蜂发病死亡.造成蜂群群势下降,生产性能低下.例如,蜜蜂囊状幼虫病、蜜蜂麻痹病.

中蜂囊状幼虫病毒的纯化、结晶与结构研究

中蜂囊状幼虫病毒的纯化、结晶与结构研究冯建勋卢火斤英张勤奋马泽微张景强黄文忠＊张学峰＊（中山大学昆虫研究所生物防治国家重点实验室，广州５１０２７５）（＊广东省昆虫研究所蜜蜂组，广州５１０２６０）＊国家自然科学基金重点项目资助中蜂囊状幼虫病是中峰生产中...

高效液相色谱法对农产品中黄曲霉毒素的测定研究

采用免疫亲和方法进行样品前处理，用甲醇一乙腈一水三元流动相体系分离黄曲霉毒素，氯化汞溶液在线衍生，荧光检测器检测，建立了新型的高效液相色谱柱后衍生测定黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2、M1）的方法。该方法在13min内完成测定，线性关系良好，5种黄曲霉毒素的线性相关系数r值均大于0．999。方法成功应用于花生、花生制品、大米、玉米等农产品。对样品进行不同水平的加标回收实验，回收率为83％-100％，相对标准偏差1．51％-4．98％（12=7），B，检出限（S／N=3）和定量下限（S／N=10）分别达到了0．05μg/kg和0．17μg/kg。

蜜蜂囊状幼虫病研究进展

蜜蜂囊状幼虫病是由蜜蜂囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)引起的一种病毒病,对蜂群危害极其严重,对我国本土蜂种的中华蜜蜂危害更甚。到目前为止,我国有20多个省发现中华蜜蜂感染此病,病害侵袭极其严重。由于该病无特效药物可以治疗,我国部分省份的部分地区由于囊状幼虫病的大流行已经导致该地区中华蜜蜂饲养数量几乎为零,给当地的蜂业生产带来巨大损失。论文从蜜蜂囊状幼虫病的流行规律、病毒的生物学特性、病害诊断方法和蜜蜂抗性机理四个方面对蜜蜂囊状幼虫病研究进展进行概述,旨在为今后有效防控蜜蜂囊状幼虫病提供参考。

营养生态条件对蜜蜂球囊菌生长及产孢的影响

从碳源、氮源、维生素、矿质元素等方面研究了营养生态条件对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis Olive＆Spiltoir)生长及产孢的影响。结果表明,营养生态条件的变化对蜜蜂球囊菌的影响极大。A.apis菌丝体生长最好的碳源是果糖,产孢量最高的是葡萄糖,不利用山梨糖和甘露糖;该菌优先利用有机氮源,不利用无机氮源中NaNO_2、H_2NCSNH_2;维生素对A.apis产孢量有极为显著的影响,复合维生素比单一维生素能更好地促进菌丝体生长,尤其对产孢更为有利;矿质元素中Mg^(2+)、P^(5+)、K^+、Zn^(2+)促进菌丝体生长和孢子的形成,Na^+对菌丝体的生长有抑制作用。

蜜蜂球囊菌分泌多种胞外酶侵染蜜蜂幼虫

对健康和患病蜜蜂幼虫血淋巴进行SDS-PAGE电泳和蛋白酶、酯酶的活性染色,以研究蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶种类及对蜜蜂侵染的作用.结果表明:健康蜜蜂幼虫血淋巴中的蛋白含量丰富,主要由4种高分子质量的蛋白组成,而患病幼虫血淋巴中的蛋白含量很少,主要蛋白组分被降解;在患病幼虫血淋巴中可以检测到健康幼虫所没有的多种蛋白酶和酯酶的活性.可见,蜜蜂球囊菌在侵染蜜蜂幼虫的过程中涉及到胞外酶的作用,这些胞外酶参与降解蜜蜂的组织,为蜜蜂球囊菌的生长提供营养.

环介导等温扩增(LAMP)技术检测蜜蜂球囊菌

【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。[方法]根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3(5'-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3')、A.apis-B3(5'-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3')、A.apis-FIP(5'-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3')和A.apis-BIP(5'-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3'),进行LAMP扩增试验,分别设置Mg^(2+)终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^(-1),dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^(-1),内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^(-1),甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mo1·L-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)、蜜蜂残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、蜜蜂囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)和以色列急性麻痹病毒(Israel acute paralysis virus,IAPV)基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^(-1)、0.2231×10^(-2)、0.2231×10^(-3)、0.2231×10^(-4)、02231×10^(-5)、0.2231×10^(-6)、0.2231×10^(-7)、0.2231×10^(-8)μg·μL^(-1)作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^(-1)Mg^(2+)、1.2 mmol·L^(-1)dNTPs、1.6 mmol·L^(-1)FIP/BIP、0.4 mol·L^(-1)甜菜碱,并在63℃反应60 min可完成检测。选用蜜蜂球囊菌、东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、蜜蜂残翅病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、黑蜂王台病毒和以色列急性麻痹病毒的基因组作为LAMP反应模板进行特异性检测,结果显示仅有蜜蜂球囊菌有扩增曲线和梯状条带,建立的LAMP检测体系有很好的特异性。将蜜蜂球囊菌基因组DNA浓度0.2231、0.2231×10^(-1)、0.2231×10^(-2)、0.2231×10^(-3)、0.2231×10^(-4)、0.2231×10^(-5)μg·μL^(-1)作为模板进行PCR反应后,检测结果为阳性,随DNA浓度降低,电泳检测不能观察到PCR的扩增产物。进行LAMP反应时,浊度曲线和电泳条带显示可检测DNA浓度为0.2231×10^(-6)μg·μL^(-1)。LAMP每反应检出量比PCR高10倍,并且方法简单、节省时间。【结论】成功建立了准确、快速、低成本的LAMP检测蜜蜂球囊菌技术,为相关研究和应用提供了技术支持。

中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因的克隆及序列分析

根据小ＲＮＡ 病毒科（ Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ） 中病毒ＲＮＡ 所具有的结构特征， 采用ｍＲＮＡｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ 提取纯化中蜂囊状幼虫病病毒（Ｃｈｉｎｅｓｅｓｃａｂｒｏｏｄ ｖｉｒｕｓ ＣＳＢＶ） 的ＲＮＡ， 并以之为ｃＤＮＡ合成的模板． 依据小ＲＮＡ病毒科中的脊髓灰质炎病毒结构蛋白基因序列设计了一对引物ＶＰ５和ＶＰ３ ， 通过ＰＣＲ 扩增获得预期大小约为１ １００ ｂｐ的ＤＮＡ 片段， 将此片段克隆到ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体上并直接测序． 序列分析表明， 该片段为中蜂囊状幼虫病病毒部分结构蛋白基因， 与意蜂幼虫囊状病病毒结构蛋白基因序列的同源性为８６－８ ％ ， 与之对应氨基酸序列的同源性高达９３－４ ％ ．

蜜蜂球囊菌荧光PCR快速检测方法的建立及应用

以蜜蜂球囊菌ITS1、ITS2和5.8 S rDNA保守序列(U68313)为参考,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,建立了一种快速检测蜜蜂球囊菌的荧光PCR方法。该方法灵敏度达1 ng/μL的阳性DNA比常规PCR高10倍。检测的特异性高,与蜜蜂幼虫芽胞杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌无交叉反应,同时可避免常规PCR因电泳造成的污染。应用该方法对蜜蜂及蜂制品的实际样品和模拟样品进行检测,结果显示所建立的荧光PCR检测方法在4 h内即可报告结果,与传统病原菌分离培养、常规PCR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可以用于蜜蜂及其制品中蜜蜂球囊菌的快速检测和进出境检疫。

蜜蜂共生菌研究进展

蜂类昆虫是自然界最主要的授粉昆虫类群,它们在保护植物多样性及维持生态系统平衡等方面发挥着极为重要的作用。介绍了蜜蜂属(Apis)和熊蜂属(Bombus)昆虫体内共生菌的种类、分布以及部分共生菌在抑制病原菌生长、抵抗寄生虫侵染、提供营养物质等方面的作用,分析了研究中有待解决的问题,并探讨了未来的研究热点,旨在为提高蜜蜂的环境适应性和防治其病虫害提供一定的参考。

基于RNA-seq数据大规模挖掘蜜蜂球囊菌的SSR分子标记

基于已获得的球囊菌转录组数据预测微卫星标记(SSR),并进行SSR位点的信息分析和SSR引物的挖掘.利用软件MISA对球囊菌转录组中42610条unigenes进行搜索,共预测出7968个SSRs,分布于5233条unigenes中,其中最主要的重复类型为三核苷酸重复(53.15%),其次为二核苷酸重复(32.32%)和四核苷酸重复(8.46%).二核苷酸重复中的基序主要是AG/CT(占总量的15.8%).针对所有的SSR位点,利用Primer Premier 5软件设计出6956对SSR特异性引物,随机选取20对引物对两个不同来源的球囊菌样品进行SSR位点扩增,共有6对引物成功扩增出符合预期的目的片段.研究结果表明,利用球囊菌转录组数据开发SSR引物是可行的.

中蜂囊状幼虫病的防治方法分析

中蜂囊状幼虫病是一种常见的蜜蜂病害,严重影响着中蜂的生产和养殖。本文主要介绍了中蜂囊状幼虫病的症状、病因以及常用的防治方法。研究发现,采用药物治疗、生物防治以及管理措施等方法综合施策,可以有效地防治中蜂囊状幼虫病。对于中蜂囊状幼虫病的防治,不同的方法应该根据实际情况进行选择和组合使用。在药物治疗中,需要严格遵循使用说明和剂量,以免对中蜂产生负面影响。在生物防治中,需要选择合适的益生菌和天敌昆虫,并且注意环境因素的影响。在管理措施中,需要加强养殖环境的清洁和卫生管理,并且要进行科学合理的蜜蜂饲养和喂养。

蜜蜂囊状幼虫病研究进展

蜜蜂作为一种重要的经济资源昆虫,常受到多种病害的影响,蜜蜂囊状幼虫病是其中危害较为严重的一种病害。本文对蜜蜂囊状幼虫病的病原、流行病学、传播途径、诊断及防治等方面的研究作了综述。