基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法

为了建立一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)检测方法,研究基于CRISPR-Cas13a系统并结合多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)技术建立了一种MSRV的检测方法。实验对MSRV序列进行多重序列比对分析后,针对MSRV衣壳蛋白(CP)基因的特异性区域设计两个靶点,并通过体外转录成特异性的crRNA,同时设计合成MIRA引物序列实现目标序列的等温扩增,最后结合Cas13a蛋白、crRNA、恒温扩增体系构建检测体系,并从高效crRNA的选择、反应温度、ssRNA报告探针浓度和Cas13a与crRNA的浓度比四个方面优化了反应体系,并采用最优检测体系对大口黑鲈样本进行检测验证。结果显示,在20μL检测体系中加入200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2及500 nmol/L ssRNA报告探针,在37℃的情况下能够获得最佳的检测效果。并且该检测体系可以检测到102 fM的MSRV病毒,具有良好的特异性和灵敏性,此外检测结果可直接通过紫外灯照射直接观察。研究基于CRISPR/Cas13a系统结合等温扩增MIRA技术建立的MSRV检测方法,可在室温下且不需要昂贵的仪器进行MSRV病毒检测,检测结果可以肉眼直接观察,能在多种场合下使用,研究结果为检测MSRV提供了有效方法。

患病异育银鲫中嗜冷黄杆菌的分离鉴定及组织病理学观察

为确定越冬期内江苏多地异育银鲫暴发性死亡的原因,本研究利用高通量测序比较了健康样品和患病样品的微生物群落多样性和结构组成的差异,分析了异育银鲫病害暴发过程中的细菌类型及特性。结果显示,在属水平上,患病样品中黄杆菌属丰度最高。在种水平上,患病样品中嗜冷黄杆菌的丰度最高,分别达到63.01%和61.31%,显著高于健康组的1.55%。根据微生物群落特征分析结果,从患病样品体表的病灶处分离出优势病原菌NJ01,通过细菌形态学、生理生化分析、16S rDNA序列比对确定NJ01菌株为嗜冷黄杆菌。人工感染NJ01菌株14 d后,1.7×10^(6)和1.7×10^(7) CFU/mL两组的死亡率达到100%,感染症状和自然发病症状一致。组织病理学观察发现,病鱼的肌细胞坏死,间质中充满了淋巴细胞;肝脏中细胞溶解坏死,细胞核消融;在脾脏中发现脾细胞散在坏死,伴随着充血的症状;肾小管上皮脱落,肾间质存在大量淋巴细胞。药物敏感实验结果显示,NJ01菌株对头孢西叮、头孢哌酮、庆大霉素和克拉霉素等敏感。研究表明,优势菌NJ01是致病菌,可通过扰乱机体正常的免疫和代谢功能导致疾病的发生。本研究首次报道了嗜冷黄杆菌在异育银鲫中的致病性,这将为大宗淡水鱼“越冬综合征”的药物防治及其致病机理研究提供参考依据。

湖北省池塘养殖大口黑鲈的鳃部外来单殖吸虫调查

为了评估外来单殖吸虫对我国养殖大口黑鲈Micropterus salmoides(Laceped e,1802)的危害和入侵风险,对湖北省池塘养殖大口黑鲈的单殖吸虫感染情况进行了调查。调查发现鳃部有2种锚首虫科(Ancyrocephalidae)单殖吸虫,通过形态学鉴定,确定其分别为异形锁钩虫Onchocleidus dispar Mueller,1936和Clavunculus bursatus(Mueller,1936),且该2种锚首虫均为外来寄生虫。在湖北大冶的大口黑鲈养殖场,异形锁钩虫和C.bursatus的感染率分别为12.90%和1.08%,平均感染丰度分别为0.14和0.02;在武汉新洲大口黑鲈养殖场,大口黑鲈仅感染有异形锁钩虫,其感染率和平均感染丰度分别为22.22%和2.14。与原产地相比,大口黑鲈引进到中国后,鳃上寄生单殖吸虫种类明显减少;异形锁钩虫在长江中游养殖的大口黑鲈中已建立种群。

鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)检测方法的建立及应用

为建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的实时荧光重组酶辅助扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法,根据AngHV的ORF 95基因序列设计引物和探针,优化反应温度,确定反应时间,并应用该方法对采集的临床样品进行检测。结果表明:本研究中建立的实时荧光RAA检测方法的最佳反应温度为39℃,反应时间为20 min;实时荧光RAA检测方法的灵敏度、特异性及重复性评价显示,RAA检测AngHV的最低检测量为1×10^(2)copies/μL,可特异性地检测AngHV,与美洲鳗鲡腺瘤病毒(American eel adomavirus,AEAdoV)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)、鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)和对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)均无交叉反应;实时荧光RAA检测方法的组内和组间变异系数均小于5%,表明实时荧光RAA检测方法灵敏度高、特异性强和重复性好;应用该方法对采集的25份临床样品进行检测显示,实时荧光RAA检测方法与qPCR方法的检出率一致,均为92%,高于普通PCR的检出率(76%)。研究表明,本研究中所建立的鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增RAA检测方法快速、灵敏、可靠、准确,可用于AngHV的临床快速检测和流行病学调查。

免疫磁珠富集水中鲤春病毒血症病毒的初步研究

为建立一种富集水中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的技术,本研究利用SVCV多克隆抗体制备免疫磁珠,通过对磁珠耦联抗体量的优化,确定该免疫磁珠有效富集SVCV的最低浓度,建立一种富集SVCV的免疫磁珠分离技术,并联合荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)技术对水中SVCV进行检测。结果显示,1 mg磁珠与75μg SVCV多克隆抗体耦联时,耦联的抗体量最大,耦联率为98.48%;耦联后的免疫磁珠对SVCV(200μL,浓度为1.54×10^(6)拷贝/μL)的富集效率最高为91.56%。以该多克隆抗体量制备的免疫磁珠富集10倍倍比稀释的SVCV(3.54×10^(6)拷贝/μL~3.54×10^(3)拷贝/μL),以确定其有效富集SVCV的最低浓度。结果显示,1 mg免疫磁珠能够使200μL病毒液(3.54×10^(3)拷贝/μL)富集率达到61.58%。表明该免疫磁珠能够有效富集SVCV。在免疫磁珠分离技术联合RT-qPCR技术检测水样品中SVCV(浓度约为1.16×10^(4)拷贝/μL)的结果显示,免疫磁珠组富集SVCV核酸量是裸磁珠组富集SVCV核酸量的1.77×10^(3)倍,是未处理组富集SVCV核酸量的1.68×10^(3)倍,免疫磁珠组富集SVCV均极显著高于裸磁珠组和未处理组(P<0.01),裸磁珠组富集的SVCV与未处理组则无显著差异(P>0.05)。本研究首次建立了一种能够有效富集水中SVCV的方法,为SVCV的监测提供了技术手段。

抗大口黑鲈弹状病毒发酵中草药的筛选及其效果评价

为筛选出能够对MSRV具有抑制效果的发酵中草药,研究通过MTT法检测8种发酵中草药(L1、L2、L3、L4、L5、X1、X2和ZHS)对EPC细胞的毒性作用,结果表明L1、L2、L3、X1、X2和ZHS未对EPC细胞造成明显的损伤和毒性,L4和L5在4 mg/mL时对细胞造成损害;通过荧光定量PCR法(qRT-PCR)筛选出X1药物(主要成分为板蓝根、鱼腥草、南芪和杏仁)对MSRV有良好的抗病毒效果;在细胞水平上通过qRT-PCR法发现X1药物能够抑制MSRV的感染;空斑实验结果表明X1药物可以降低约10倍MSRV的病毒滴度。在鱼体水平上设置空白对照组、药物对照组、攻毒组、预防组和治疗组,评价X1药物对MSRV的抗病毒效果,结果表明经X1药物处理后,治疗组可以将大口黑鲈的存活率提高20%;通过qRT-PCR法检测大口黑鲈组织中病毒载量,结果表明X1药物显著抑制MSRV在肝脏、脾脏组织中的复制;通过组织病理学观察发现X1药物可以抑制MSRV引起的在肝脏、脾脏组织病变。研究为发酵中草药在水产养殖中的应用提供新的思路,为开发抗MSRV药物提供参考依据。

可口革囊星虫肠道产蛋白酶菌株的筛选及鉴定

为分离鉴定可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)肠道细菌,获得产蛋白酶菌株,以野生和养殖可口革囊星虫为材料,通过常规细菌培养获得部分肠道菌群,利用脱脂乳蛋白培养基筛选产蛋白酶的菌株,采用16S r RNA对其种属进行鉴定,并测定其蛋白酶活力。结果表明,从野生可口革囊星虫肠道分离得到5株产蛋白酶菌株,其中WE6属于弧菌属(Vibrio),WE16属于盐芽孢杆菌属(Halobacillus),WG4和WP1属于芽孢杆菌属(Bacillus),WP2属于微球菌属(Micrococcus);从养殖可口革囊星虫肠道分离得到6株产蛋白酶菌株,其中CE4属于微球菌属,CE5、CE11及CP6属于芽孢杆菌属,CE17属于希瓦氏菌属(Shevagella),CP7属于寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。各菌株蛋白酶活力测定结果显示,水解圈直径与其相关性最大,pearson相关系数为0.628。野生和养殖可口革囊星虫肠道中占据优势的产蛋白酶细菌均为芽孢杆菌属;其中微球菌属和芽孢杆菌属产蛋白酶活力较高。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法的建立

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测。实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为10^(3)cfu/mL和100 pg/μL。利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致。综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法。该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持。

鱼用催产激素在倒刺鲃属( Spinibarbus )鱼类人工繁殖中的应用进展

倒刺鲃属(Spinibarbus)鱼类是我国地方特色鱼类,其人工繁殖必须借助催产激素。近年来,倒刺鲃属鱼类鱼苗需求激增,供不应求。本文从神经系统和内分泌激素对鱼类性腺发育成熟的调节、倒刺鲃属鱼类的繁殖习性、鱼用催产激素种类、倒刺鲃属鱼类催产激素和使用剂量、催产激素的使用方式和配制等方面综述了鱼用催产激素在倒刺鲃属鱼类人工繁殖中的应用进展,以期为倒刺鲃属鱼类规模化生产提供理论基础和实践方案。

罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗不同免疫途径最适宜免疫温度的研究

为了获得罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗不同接种途径最适宜的免疫温度,试验将罗非鱼(Oreochromis niloticus)饲养于4个水温(22℃、26℃、30℃、35℃)中,每个饲养水温分为4组,分别为浸泡组、注射组、口服组和空白对照组,每组40尾。浸泡组罗非鱼链球病疫苗浸泡浓度为1×10^(7)cfu/mL,浸泡时间为15 min;注射组腹腔注射疫苗,疫苗菌液浓度为1×10^(8)cfu/mL,0.2 mL/尾;口服组将疫苗均匀喷洒至饲料表面,晾干投喂,分别于试验第1,3,7天口服接种,疫苗菌液浓度为1×10^(8)cfu/mL,0.2 mL/尾。于免疫后第5,10,15天每组随机选取3尾采集血液及脏器组织,检测免疫后疫苗抗原组织分布、血清抗体水平和溶菌酶活性,计算疫苗相对免疫保护率。结果表明:注射组免疫后第5,10,15天罗非鱼脾脏组织均可检测到疫苗抗原;饲养水温为35℃时,注射组免疫后第5,10,15天血清抗体水平极显著高于空白对照组(P<0.01);饲养水温为22℃时,浸泡组、注射组和口服组血清溶菌酶活性显著或极显著高于空白对照组(P<0.05或P<0.01)。随着饲养水温的升高,浸泡组相对免疫保护率逐渐降低,22℃时为52.33%;注射组相对免疫保护率逐渐升高,与饲养水温呈正相关,饲养水温为22℃、26℃、30℃、35℃时相对免疫保护率分别为21.53%、68.25%、85.64%和90.43%;口服组相对免疫保护率先升高后下降,26℃饲养水温罗非鱼免疫效果最好,相对免疫保护率为54.51%。说明罗非鱼链球病疫苗浸泡免疫接种最适饲养水温为22℃,注射免疫接种最适饲养水温为35℃,口服免疫接种最适饲养水温为26℃。

草鱼源鲁氏耶尔森菌的分离鉴定及药敏试验

为查明临沂蒙阴县某草鱼养殖场出现草鱼暴发性死亡的病因,从患病草鱼肝脾肾混合组织中分离纯化菌株,通过形态学观察、16S rRNA基因序列及其系统发育分析,确定其分类地位,利用药敏纸片扩散法检测其耐药特性。结果表明,分离的菌株是一种短杆状革兰阴性菌,在LB平板上形成表面光滑、边缘整齐、不透明的圆形乳白色菌落;基于16S rRNA基因序列构建系统发育树显示,该菌株与鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)聚在同一分支,序列同源性高达100%;在1%氯化钠(NaCl)胰胨水、3%NaCl胰胨水、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、MR-VP、β-半乳糖苷酶、甘露糖、甘露醇等8项试验中,结果呈阳性,与鲁氏耶尔森菌特征相近,确定分离株为鲁氏耶尔森菌。该菌株具有多重耐药性,对万古霉素、麦迪霉素、头孢唑啉、红霉素等6种药物耐受;对环丙沙星、头孢曲松、诺氟沙星、四环素等14种药物敏感。

斑石鲷irf3基因鉴定及其在虹彩病毒感染下的表达模式

干扰素调节因子(irf3)是干扰素调节因子(IRF)家族的一员,是I型干扰素依赖性免疫反应的主要转录调节因子,在针对DNA和RNA病毒的先天免疫反应中发挥重要作用。本研究中,斑石鲷irf3基因(Oplegnathus punctatus interferon regulatory factors 3,Opirf3)来自实验室斑石鲷基因组数据库,经分析鉴定Opirf3的CDS序列全长1362 bp,可编码453个氨基酸,预测其蛋白分子量为50.0 ku,理论等电点为4.97,有一个IRF结构域和一个IRF-3结构域。荧光定量分析结果显示,Opirf3在斑石鲷肝脏、鳃、心脏、皮肤、脾脏、肠、脑、肾脏、胃和头肾组织均有表达;虹彩病毒感染7 d时,免疫组织肝脏、脾脏和肾脏中Opirf3的表达水平显著上调。斑石鲷肾细胞系体外刺激实验显示,不同浓度poly I:C刺激后,Opirf3的表达量较对照组均显著升高,poly I:C浓度为100μg/mL时,肾脏细胞中Opirf3的相对表达水平升高,为对照组的86.8倍。siRNA干扰后,斑石鲷肾细胞系中Opirf3表达水平显著下调30%,下游基因IFN-α、CD40、CD80和IL-1β显著下调,IL-6显著上调。以上结果可能表明Opirf3基因参与了I型IFN在斑石鲷抗虹彩病毒过程中的先天免疫反应。本研究可为斑石鲷抗病分子育种提供理论依据。

基于核酸适体的高通量模型筛选抗大口黑鲈虹彩病毒药物

【目的】利用可特异性识别大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Largemouth bass virus,LMBV)的核酸适体LBVA1建立药物高通量筛选技术(Aptamer LBVA1-based high-throughput screening,LBVA1-AHTS),以快速筛选有效抗LMBV药物。【方法】用探针FAM-LBVA1检测感染不同浓度[感染复数(MOI)分别为0、0.05、0.10、0.20]LMBV 48 h,以及感染LMBV 0、6、12、24和48 h的胖头鱥(Pimephales promelas)肌肉细胞(Fathead minnow cells,FHM)荧光值,并用激光共聚焦及荧光定量PCR(RT-qPCR)验证LMBV感染情况;将利巴韦林、阿昔洛韦、加巴喷丁、茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯等9种药物分别以安全工作浓度与LMBV混匀,加入FHM细胞共孵育,运用探针FAM-LBVA1及RT-qPCR技术检测各组LMBV感染情况,比较两种方法检测的药物抗LMBV感染效果,筛选出有效抗LMBV药物。【结果】探针FAM-LBVA1检测及RT-qPCR技术验证结果均表明,在感染复数(MOI)为0.20、感染时间为48 h时,对LMBV感染的检测效果最佳。9种药物抗LMBV效果筛选结果表明,LBVA1-AHTS技术与RT-qPCR技术两种筛药方法筛选出利巴韦林、加巴喷丁、金刚烷胺、卡马西平、茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯7种药物的抗病毒效果一致,其中茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯3种药物具有抗LMBV的效果,其余4种药物无明显抗病毒效果,两种方法一致率近80%。【结论】建立的LBVA1-AHTS模型可快速、准确、高效筛选出抗LMBV病毒药物,为快速筛选抗病毒药物提供理论和技术基础。

基于核酸适体LYGV1c的酶联吸附法检测石斑鱼虹彩病毒感染

【目的】利用核酸适体LYGV1c构建可快速、准确识别石斑鱼虹彩病毒(Grouper iridovirus Guangxi strain,SGIV-Gx)感染的酶联吸附法(Aptamer LYGV1c-based enzyme-linked apta-sorbent assay,LYGV1c-ELASA),为提高水产疫病检测及防控效率提供理论支持。【方法】基于生物素标记的LYGV1c(Bio-LYGV1c)开发核酸适体酶联吸附法(LYGV1c-ELASA)检测SGIV-Gx,通过对Bio-LYGV1c特异性、灵敏性、稳定性等实验评估其检测性能。通过珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂)SGIV-Gx感染试验进行活体验证,同时用荧光定量PCR(qPCR)测定衣壳蛋白基因(MCP)的表达,与LYGV1c-ELASA进行比较,验证该酶联吸附法检测的可信度。【结果】LYGV1c-ELASA的方法可特异性地识别SGIV的感染,Bio-LYGV1c识别SGIV感染的最适工作浓度为500 nmol/L,最适孵育时间为20 min,最适结合温度为4~28℃,LYGV1c-ELASA最低检测限为5×103 mL-1。活体验证结果表明,随着注射的SGIV-Gx浓度的升高,LYGV1c-ELASA检测出的石斑鱼体内病毒450 nm处的光密度(OD450)的值升高;qPCR结果表明,SGIV-Gx的MCP的表达量升高,与LYGV1c-ELASA检测结果相一致。【结论】建立的LYGV1c-ELASA技术不仅可用于体外检测,同时也适用于活体检测。LYGV1c-ELASA技术可实现对石斑鱼养殖过程中石斑鱼虹彩病毒病的快速诊断、实时监控。

阪崎克罗诺杆菌双抗夹心酶联免疫吸附检测方法的建立

为建立阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的免疫学快速检测方法,分别制备了阪崎克罗诺杆菌的特异性单抗和多抗,建立阪崎克罗诺杆菌的双抗夹心酶联免疫吸附DAS-ELISA检测方法。结果:获得4株抗阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体阳性细胞株,分泌抗体效价分别是1∶128000、1∶32000、1∶256000和1∶256000,抗阪崎克罗诺杆菌兔多克隆抗体效价是1∶128000。建立的阪崎克罗诺杆菌DAS-ELISA检测方法,分别以抗阪崎克罗诺杆菌兔多抗和单抗作为捕获抗体和检测抗体,兔多抗的最佳稀释度为1∶4000,单克隆抗体最佳稀释度为1∶1000,灵敏性可达1×106 CFU/mL;该检测方法具有良好的特异性,与常见的6种食源性病原菌都没有交叉反应,且能够同时检测6种克罗诺杆菌属细菌;重复性结果显示,该检测方法的批内批间变异系数均小于15%,具有良好的重复性。综上,利用抗阪崎克罗诺杆菌的单抗和兔多抗成功建立了DAS-ELISA方法,该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可为阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供技术支撑。

大口黑鲈烂身病病原菌的分离鉴定及其药物敏感性

从湖南省醴陵市某大口黑鲈工厂化养殖场中患烂身病的大口黑鲈体表溃疡处分离得到1株病原菌MS315509,经形态学和分子生物学鉴定,确定该病原菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。人工感染结果显示,MS315509对大口黑鲈鱼苗的半数致死剂量为5.47×10^(7)cfu/mL,为弱毒株;MS315509携带细胞兴奋性肠毒素基因(alt)、细胞毒性肠毒素基因(act)和黏附素基因(aha1)3种毒力基因;采用12种抗生素与12种中草药对菌株MS315509进行药物敏感性试验,结果表明MS315509对庆大霉素、头孢拉定、石榴皮、苏木、五倍子、诃子等高度敏感,对四环素、头孢唑啉、卡那霉素、苯唑西林、恩诺沙星、青霉素、强力霉素、链霉素、黄连、艾叶和熟地黄等表现出耐药性。

GCRV感染存活草鱼的血清蛋白表达特性

为挖掘草鱼关键抗性分子,研究利用4D label-free定量蛋白质组学技术系统分析了团队前期获得的GCRV感染存活草鱼(候选抗性草鱼)与对照草鱼的血清蛋白表达差异。共鉴定到858个草鱼血清蛋白,329个蛋白在两类草鱼中差异表达,其中163个蛋白在候选抗性草鱼血清中显著高表达,166个蛋白显著低表达。差异表达蛋白的功能主要注释为体液免疫反应调节相关蛋白,显著富集到补体凝血级联、细胞黏附和铁死亡等信号通路。对差异表达的免疫相关蛋白进行分析发现,候选抗性草鱼血清中体液免疫分子MASP2、C4a、C4b、C7b、C8b、C8g、C9、CFI、C3a.1、C3a.2、C3a.3和C3a.6等补体和抗原提呈相关免疫分子MHC1UBA和IGL4V8等蛋白表达水平显著高于对照草鱼,而T细胞免疫相关分子TRAV、IGHV1-1、IGHV2-1、IGHV6-1、IGHV3-2和IGHV11-2等蛋白表达水平显著低于对照草鱼。免疫印迹检测进一步证实,以C3和IgM为代表的体液免疫分子在候选抗性草鱼血清中显著高表达,可能与草鱼抗病能力关联。研究将为高抗性草鱼的选育提供可参考的分子资源。

大刺鳅源鰤鱼诺卡氏菌的分离、鉴定与药物敏感性检测

【目的】分离、鉴定2022年福建省福州市某养殖场养殖的大刺鳅体表溃烂的病原,并进行药物敏感性检测,旨在为该病的防治提供参考。【方法】从患病大刺鳅体表脓肿处的脓汁中分离纯化出一株细菌,通过形态观察、生理生化特性检测及16S rDNA基因序列比对分析对该菌株进行鉴定,同时对健康大刺鳅进行人工感染试验;采用纸片扩散法检测菌株对37种药物的敏感性,并对mce1A、mig、pup、dop、whiB3、phoP、phoR 7种毒力基因进行PCR检测。【结果】从患病大刺鳅体表脓肿处分离到形态一致的菌株,将其命名为MSK20220613。经测序及Blast比对,该菌株与NCBI数据库中鰤鱼诺卡氏菌核苷酸序列的同源性高达99.86%,人工感染试验结果与自然发病的鱼体症状相似。药物敏感性检测结果显示,MSK20220613菌株对新霉素、多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考、环丙沙星、氧氟沙星、万古霉素等21种药物敏感;对哌拉西林、青霉素、呋喃唑酮、诺氟沙星等16种药物耐受。毒力检测结果显示,MSK20220613菌株携带mce1A、pup、phoP、phoR 4种毒力基因。【结论】患病大刺鳅的病原为鰤鱼诺卡氏菌。

肉桂醇提物对大口黑鲈虹彩病毒的体外抗病毒作用

【目的】探究肉桂醇提物在大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(LMBV)感染中的抗病毒效果及作用机制,为开发抗LMBV药物提供参考。【方法】采用CCK-8试剂盒检测、结晶紫染色观察、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测、病毒滴度[半数组织培养感染剂量(TCID50)]测定等方法确定肉桂醇提物在胖头鱥肌肉细胞系(FHM)上的安全工作浓度,评估肉桂醇提物在细胞水平对LMBV的抗病毒效果,分析其抗LMBV机制。【结果】肉桂醇提物在≤12.5μg/mL的质量浓度范围内对FHM细胞无明显毒性。FHM细胞与LMBV以及质量浓度分别为12.5、6.25、3.125μg/mL肉桂醇提物共孵育后,细胞病变明显减少,结晶紫染色后可见活细胞数明显升高,MCP、ICP46基因的表达量显著降低(P<0.01),且抗病毒效果有剂量依赖性。12.5μg/mL肉桂醇提物与LMBV共孵育后接入FHM细胞,细胞中MCP、ICP46基因的相对表达量以及TCID_(50)极显著下降(P<0.01);FHM细胞与经肉桂醇提物处理的LMBV共孵育后,细胞中LMBV MCP和ICP46基因的相对表达量显著低于未用肉桂醇提物处理的LMBV感染组(P<0.01);在LMBV感染FHM细胞后,接入肉桂醇提物的FHM细胞中MCP和ICP46基因的相对表达量显著下降(P<0.05);在LMBV感染FHM细胞3 h后用肉桂醇提物处理8 h的FHM细胞中MCP和ICP46基因的相对表达量显著下调(P<0.05)。【结论】肉桂醇提物可降低LMBV的感染力,干扰LMBV侵染宿主细胞过程中的吸附、侵入及复制,有良好的抗LMBV作用,可作为环保、高效的抗LMBV渔用药物候选者。