大口黑鲈杀鱼爱德华氏菌的分离鉴定及耐药性分析

2022年3月,广东珠三角地区养殖的大口黑鲈(Micropterus salmoides)发生了大规模暴发性死亡,特别是佛山市南海区,死亡率高达20%~50%。为明确大口黑鲈死亡原因,采集佛山市南海区沙头镇腹部膨大和内脏缺血、体长25~35 cm濒死病鱼42尾,进行组织病理分析、病原分离与鉴定、病原菌毒力和耐药性检测等,为该病的诊断和防控提供科学依据。结果显示,病鱼主要临床症状为严重腹水、肝脏和鳃缺血以及肝脏和肾脏肿大。病理切片显示。肝脏和肾脏均严重组织变性和细胞坏死。从肝脾肾组织中均分离出大量菌落形态一致的细菌,其中肝组织细菌丰度最高。生化鉴定和16S rRNA分子鉴定结果表明:细菌S1为杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida),在系统进化树中与杀鱼爱德华氏菌(MN203719.1)自然聚为一支。动物回归感染实验表明该菌为引起大口黑鲈死亡的致病菌,且毒力很强。药敏试验结果显示,该菌对氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素等药物敏感,对利福平、阿莫西林、四环素耐受。

环境DNA揭示东江流域水生昆虫生物多样性变化及影响因素

以东江流域为例,通过环境DNA技术探究了水生昆虫群落的空间分布规律及其环境影响因子。结果显示:1)水生昆虫物种丰富度由高到低顺序为:双翅目(7科)>蜉蝣目(6科)>毛翅目(2科)=蜻蜓目(2科)=鞘翅目(2科)>鳞翅目(1科)。双翅目(84.99%)和蜉蝣目(14.89%)共占总reads数99.88%,摇蚊科(69.20%)、四节蜉科(14.36%)及蚊科(14.26%)三个科合计占总reads数97.82%。2)物种丰富度指数、香农维纳指数、辛普森指数与功能丰富度指数(FRic)、功能离散度指数(FDiv)均与距河口距离呈正相关关系。功能均匀度指数与距河口距离呈负相关关系。3)海拔是影响物种丰富度最重要的环境因子(P<0.01),COD是影响物种丰富度的重要环境因子(P<0.05)。海拔、DO、COD是影响功能丰富度的重要环境因子(P<0.05)。

抗石斑鱼虹彩病毒药物的体外筛选

【目的】体外筛选抗石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)的药物,为石斑鱼虹彩病毒病防控提供理论依据。【方法】应用石斑鱼脾脏组织细胞系(Grouper spleen,GS)-SGIV感染模型,从4种药物[盐酸金刚烷胺(AMA)、更昔洛韦(GCV)、绿原酸(CGA)和黄芩苷(BI)]中筛选有效的体外抗SGIV药物。通过显微镜观察和细胞活力检测不同药物对GS细胞的毒性,确定不同药物对GS细胞的安全工作浓度后,通过实时荧光定量PCR、蛋白印迹分析等探究药物对SGIV感染复制的调节作用。【结果】细胞活力检测结果显示,4种药物AMA、GCV、CGA和BI处理GS细胞的最高安全工作浓度分别为200、200、1600和40μg/mL。显微镜下观察发现,AMA和GCV处理GS细胞后对SGIV感染的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)进程有明显的抑制作用,而CGA和BI没有明显抑制效果。实时荧光定量PCR检测结果显示,AMA和GCV处理可显著降低SGIV主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)和病毒囊膜蛋白(Viral protein VP088)的基因转录(P<0.05,下同)。蛋白印迹分析表明AMA和GCV对SGIV的MCP蛋白合成具有明显抑制效果。倒置荧光显微镜观察发现AMA和GCV处理明显减少感染过程中病毒加工厂的形成,提示AMA和GCV可能影响病毒装配。病毒滴度测定结果显示,AMA和GCV处理可显著降低SGIV感染过程中子代病毒的产量。【结论】应用SGIV体外感染模型筛选到的2种药物AMA和GCV具有一定的抗SGIV活性,且这种抗病毒能力主要通过抑制病毒的基因转录和蛋白合成,从而影响病毒的装配和产量。

一例冰下低温爆发的锦鲤疱疹病毒病的鉴定

2013年4月初低温下，吉林省白山地区某网箱养殖场鲤（Cyprinus carpioL．）大量死亡，病死鲤无明显临床病变。采用PCR扩增技术检测了这些病鱼，结果表明，该低温爆发的疾病为锦鲤疱疹病毒病（KHVD）。这种病常爆发在水温为18-28℃的春秋季，冰下爆发还未有报道。本次锦鲤疱疹病毒病的鉴定，对于锦鲤疱疹病毒感染鲤温度条件的变化和疾病的预防提供了参考。

实时荧光定量PCR检测克氏原螯虾体内白斑症病毒(WSSV)的动态变化

本文建立了白斑症病毒（WSSV）实时荧光定量PCR标准曲线，结果显示其线性关系良好，利用建立的WSSV实时荧光定量PCR技术检测感染了WSSV后克氏原螯虾（Procambarus clarkii）组织内病毒数量的时序动态变化。注射WSSV粗提液感染克氏原螯虾，在感染后0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h分别取螯虾鳃、血淋巴、心脏、附肢、造血组织和肌肉，提取组织DNA，实时荧光定量PCR测定WSSV浓度，发现感染后3h在附肢、鳃、血淋巴和造血组织中检测到病毒，12h时在各组织中皆检测到病毒，但浓度较低；24~48h内WSSV浓度呈指数增长，此时螯虾出现少量死亡；60~72h内WSSV数量缓慢增长达到平台期，螯虾累计死亡率快速升高。不同组织中的WSSV浓度有较大差异，附肢中浓度最高，血淋巴、鳃、心脏和造血组织稍低，肌肉中WSSV浓度最低；附肢中WSSV动态变化代表了WSSV增殖变化规律，是很好的病毒检测与病程进展评估材料。本文结果可为WSSV的早期诊断提供技术支持，为阐明WSSV感染增殖规律提供资料。

抗大口黑鲈弹状病毒中草药的筛选及抗病毒效果

采用MTT法,选择黄芪多糖、白花蛇舌草、金银花、葡萄糖酸锌、板蓝根、白芍、连翘及黄藤素8种中草药对大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV)进行体外抗病毒试验,并挑选黄芪多糖,利用荧光定量PCR方法研究其对病毒复制和宿主细胞内凝集素基因(Intelectin)表达的影响。体外抗病毒试验结果显示,黄芪多糖抗MSRV效果最好,兼具显著的阻断、抑制和中和病毒的效果,其最高阻断作用率为59.13%,最高抑制率为21.64%,最高中和率为105.46%。同时,黄芪多糖还可以抑制MSRV的复制,上调细胞Intelectin基因的表达。另外,连翘、金银花和白芍对MSRV分别有显著的阻断作用(阻断作用率为16.92%)、抑制作用(抑制率为21.64%)、中和作用(中和率为54.01%)。结果表明,黄芪多糖相较试验中其他中草药制剂具有更好的抗MSRV效果,可为MSRV的药物防控提供参考。

真鲷(Pagrosomus major)杆状病毒超微结构与细胞病理学初步研究

1995年电镜检测患病真鲷肠上皮组织 ,在细胞质中发现了一种新的病毒粒子及其发生基质。病毒呈杆状外形为 ( 1 30～ 2 0 0 )× ( 360～ 40 0 ) nm,具囊膜 ,囊膜与核心间有 1 0～ 1 2 nm低密度间隔。病毒以溶酶体为载体形成病毒包涵体并进行病毒粒子装配 ;形态学上暂定为真鲷杆状病毒 ( Pagrosomus major Baculovirus,PMBV)。细胞病理变化呈现粗面内质网核糖体脱落 ,部分线粒体溶解 ,溶酶体膨大 ,有大量包涵物 ,核膜有轻微膨胀变形等病变。

金鱼造血器官坏死病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

金鱼造血器官坏死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV)是一种可感染金鱼等鲤科鱼类,并可导致其死亡的疱疹病毒。为了快速检测病原,本研究根据GFHNV的主要衣壳蛋白(Major captor protein,MCP)序列中的一段保守基因序列,设计引物和Taq Man探针,建立了GFHNV特异性的实时荧光定量PCR检测方法 ;并利用PCR反应扩增出的MCP基因,制备了p UC-GFHNV重组质粒作为阳性对照。经试验,该方法检测限最低可达10个拷贝数的目的基因,而且与锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)、甲鱼虹彩病毒(Softshell turtle iridovirus,STIV)、流行性造血器官坏死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis,EHNV)、斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus,CCV)以及白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)等5种水生动物病毒无交叉反应。该方法具有简便、快速、敏感、特异等优点,为该病的诊断与病原检测提供了一个重要手段。

斑点叉尾鮰病毒疫苗的研制

为了控制斑点叉尾鮰病毒性出血病造成大规模死亡,用离心干燥法研制出斑点叉尾鮰病毒疫苗,通过试验检测,可使斑点叉尾鮰的成活率稳定在80%以上,从而提高斑点叉尾鮰养殖业的经济效益。

鲑鱼甲病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法研究

鲑鱼甲病毒(Salmonid alphavirus,SAV)是鲑鱼胰脏病(Salmon pancreas disease,PD)病原,主要感染鲑科鱼类,目前在我国尚未分离到。为提高出入境鱼类中的SAV检测效率,根据SAV nsP1基因片段,设计3对特异性引物,建立了检测SAV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。该方法使用25μL反应体系,经优化后的反应温度为65℃,反应时间为1 h,检测限可达10个拷贝数的病毒核酸,且不与传染性鲑鱼贫血病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒、病毒性神经坏死病病毒、草鱼呼肠孤病毒和鲤春病毒血症病毒的RNA产生交叉反应。在反应体系中加入染料后,反应结果肉眼直接可见。本研究建立的RTLAMP方法是一种特异性强、方便快捷的SAV检测方法,适合SAV的现场初筛和核酸检测。

鱼类病毒性神经坏死病研究现状

鱼类病毒性神经坏死病是近年来严重危害海水鱼类,引起暴发性流行的重大病害之一。目前,已知受神经坏死病毒感染的鱼类达40多种。该病毒包括4 种血清型,即红鳍东方鲀神经坏死病毒、拟鲹神经坏死病毒、条斑星鲽神经坏死病毒、赤点石斑鱼神经坏死病毒。患病鱼常表现出游泳异常,身体失去平衡等典型神经性疾病症状。病理组织学观察可见中枢神经系统特别是脑和视网膜出现严重的坏死、空泡化。病毒可通过垂直和水平两种途径传播。关于病毒的命名、感染机制及其防治还需深入研究。

TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用

本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA,利用针对锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针,经反应体系优化,应用实时荧光定量PCR检测技术,通过对荧光信号的实时监测实现对KHV的定量检测。整个过程快速、简捷,操作简单,可对KHV进行快速有效的诊断,具有一定的应用价值。

斑点叉尾病毒(CCV)结构蛋白的鉴定

采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化斑点叉尾病毒(Channel catfish virus,CCV),利用电喷雾-四级杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)对得到的样品进行分析。结果共鉴定了13种结构蛋白,包含1种未报道过的结构蛋白ORF22。实验结果为进一步研究CCV结构蛋白的功能及蛋白质组学提供了参考。

鳜传染性脾肾坏死病毒ICR489基因序列分析

报道了鳜鱼传染性脾肾坏死病毒 (ISKNV)的ICR489基因结构及其序列分析。对ISKNVDNAKpnⅠB酶切片段的序列分析结果发现该序列中含有完整的ICR489基因。ISKNVICR489基因完整读码框为 10 11bp ,GC含量为 5 6 97% ,等电点为 6 82 ,编码一个长为 337aa、相对分子质量为 382 70的推定蛋白。结构分析发现该基因起始密码子上游具有启动子元件TATAbox,有反向重复序列可形成茎环 ,并有一段回文序列。ISKNV与其它 3种虹彩病毒 (FV3、RRV和LCDV_1)的ICR489基因氨基酸序列具有一定的同源性 ,但ISKNV与它们的同源性不高 。

锦鲤疱疹病毒ORF1基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus Virus,KHV)诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORF1基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)后诱导表达,再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS-PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37.3KD,为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1:27000。表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。

尖吻鲈Lates calcarifer虹彩病毒病的诊断

对广东珠海一养殖池塘中尖吻鲈Lates calcarifer的发病情况进行了调查。调查发现,病鱼体色发黑,剖检可见鳃充血发紫;空肠空胃,肠道微红,脾和肾肿大,有出血点,胆囊充盈,有胆汁渗出,肾发黑,有出血点,其他组织器官无明显变化。从病鱼的鳃、肝、肾、肌肉、肠道,和血液中未检查到寄生虫,从肝、脾和肾中未分离到致病菌。参考世界动物卫生组织(Office International des Epi-zooties,OIE)设计引物,提取自然发病鱼各种组织的DNA作为模板,扩增出了预期大小的特异性产物。测序比对显示,扩增的条带的基因序列与真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridovirus,RSIV)的基因序列同源性高达98.6%。病理切片显示:肝和脾出现肿大细胞。因此,引起尖吻鲈发病死亡的原因是肿大细胞病毒属虹彩病毒感染。

一种真鲷虹彩病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

真鲷虹彩病毒一直被世界动物卫生组织列入必报疫病病原目录,该病毒与传染性脾肾坏死病毒在基因序列上没有区别。为了快速检测病原,本文根据传染性脾肾坏死病毒主要衣壳蛋白序列中一段基因保守区设计引物和TaqMan探针,建立了真鲷虹彩病毒特异性实时荧光定量PCR检测方法,并利用PCR反应扩增出的衣壳蛋白基因制备了pGEM-T/真鲷虹彩病毒重组质粒作为标准阳性对照。经试验,反应在模板量102-106拷贝浓度范围内有较好的线性关系,检测限最低可达100拷贝数,而且与流行性造血器官坏死病毒、甲鱼虹彩病毒等6种水生动物病毒无交叉反应。结果证明该方法具有简便、快速、敏感、特异等特点,它的建立为该病诊断与病原检测提供了一个重要手段。

锦鲤疱疹病毒感染鲤鱼的动态病理损伤及病原组织分布

【目的】研究锦鲤疱疹病毒(CyHV-3)感染鲤鱼的侵染规律与动态病理损伤,为CyHV-3致病机理的研究奠定实验基础,同时为有效防控锦鲤疱疹病毒病提供参考。【方法】采用浸泡法对鲤鱼进行人工感染试验,于不同时间点剖检采样,进行动态病理学观察和荧光定量PCR检测,选择具有代表性的外部(鳃)和内部器官(肾脏)进行动态病理学观察。【结果】鳃小片呼吸上皮细胞增生严重并伴有大量炎症细胞浸润,肾脏主要表现为间质性肾炎,肾小管上皮细胞变性坏死。试验鱼在感染前期病毒含量最高的是鳃组织,肠道中未检测到病毒,随着感染时间的延长,各组织内的病毒含量逐步增加。病毒感染10 d后,鳃、肾脏以及脑组织的病毒含量达到最高值,随后病毒量保持稳定。脾脏、肝脏和肠道中病毒含量的最高值出现在感染第14天。【结论】CyHV-3在鲤鱼体内先入侵鳃组织,随后到达肾脏、脾脏等全身各组织器官中。

海水鱼神经坏死病毒致病机理研究进展

神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)主要分布在地中海和太平洋西海岸,已在120多种鱼中被检测到,能引起鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis,VNN),是对海水鱼类危害重大的病原之一。目前,随着神经坏死病毒的基因序列、类型、诊断和预防技术等方面研究的不断深入,其致病机理的报道也越来越多。本文概述了病毒附着、致病基因、细胞凋亡以及免疫逃避等几个方面的研究现状。

鲤浮肿病毒人工感染锦鲤的试验研究

为研究鲤浮肿病毒的感染方式及在锦鲤各组织器官中的动态分布,在水温20～22℃,溶解氧7～8mg/L试验条件下,采用注射、浸泡、划伤后浸泡3种方式人工感染锦鲤,观察了试验鱼的发病和死亡情况;检测了鲤浮肿病毒在感染鱼体内各组织器官中的存在情况,探讨了主要被感染组织的病理变化。试验结果显示,采用注射、浸泡、划伤后浸泡3种方式均可导致健康锦鲤感染该病毒,病鱼出现昏睡、烂鳃、凹眼等症状,累积死亡率35%～88%。锦鲤感染该病毒后至少有3d的潜伏期,随后病毒在鳃组织中大量增殖,至7d达到高峰,病毒量314.8个/ng,之后病毒量开始逐渐下降,至12d在鳃组织中检测不出病毒。鲤浮肿病毒在肾、肝、脑、肌肉和脾中存在的时间较短且病毒量较低,在血液和肠道中未检出。结合鳃组织病理切片可知,鳃为该病毒感染的主要靶器官。本研究结果为鲤浮肿病的诊断和防控提供了一定的科学依据。