鲤病毒病原的感染性测定

为查明养殖鲤（Cyprinus carpio）突然大批发病死亡的原因，对鲤病样品进行了细胞攻毒、空斑测定、电镜观察，以及鱼体感染等实验。先以患病鲤的组织匀浆液，经过滤后，分别接种到草鱼鳍条细胞（GCF）、鲤上皮瘤细胞（EPC）等14种培养细胞中。利用倒置显微镜观察显示，在1-2d内，该病鱼组织匀浆液可使其中9种细胞出现典型的细胞病变。收集出现病变的细胞液（即病毒悬液），进一步进行病毒滴度检测、空斑测定和鱼体感染实验。结果显示，在GCF细胞上的病毒滴度为10^7.3TCID50／mL；在FHM，TSB和GCO等细胞中可产生直径1～4mm的圆形空斑，空斑的大小与宿主细胞的种类和接种的病毒浓度有关。通过对感染细胞制备的超薄切片和病毒负染样品进行电镜观察，显示这是一类呈典型子弹头样的弹状病毒颗粒。感染了病毒悬液的鲫和鲤先后在第2天和第3天开始出现病症，间隔1～2d后发病的鱼开始死亡，至第14天，两种感染鱼的死亡率均达到83．3％。收集人工感染后濒死的鲫和鲤，分别制备组织匀浆液，回接感染鱼类培养细胞，24h内能使其出现与原发病鲤组织匀浆液所引起的类似的细胞病变。因此证实患病鲤是由病毒病原感染所致。[中国水产科学，2006，13（4）：617—623]

鲤鱼细菌性败血症及穿孔病病原菌与嗜水气单胞菌标准株特性的比较研究

从发病渔场分离的鲤鱼细菌性败血病S - 1、S - 2致病菌株 ,鲤鱼穿孔病S - 3、S - 4致病菌株 ,与嗜水气单胞菌标准株作为对照 ,进行人工感染试验对健康鲤鱼具有很强的致病力 ,出现与自然病鲤相似的症状 ,并从人工感染发病鱼体内分离出同样特性的菌株 ,通过菌体形态 ,培养特性和生化反应等测定 ,符合嗜水气单胞菌的特性 ,并与嗜水气单胞菌标准株作平行试验 ,结果一致 ,确定鲤鱼细菌性败血症和穿孔病均是同一病原 。

禾花鲤细菌性败血症病原菌的分离鉴定及毒力基因检测

以常规方法对广西全州县患病禾花鲤进行病原菌的分离,人工感染试验确定病原菌的致病性,API全自动细菌鉴定仪和16S rRNA基因序列分析对病原菌进行生化鉴定和分子鉴定,K-B纸片扩散法进行病原菌的药敏试验,毒力基因检测为PCR扩增法。结果表明,从患病禾花鲤肝脏组织分离到2株优势菌株HHL130和HHL165,对健康禾花鲤的致死率均为100%,是禾花鲤细菌性败血症的病原菌;API生化鉴定和16S rRNA鉴定结果,HHL130和HHL165均为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),与标准菌株Aeromonas hydrophila ATCC 7966的同源相似度为99.6%,亲缘关系最近;2株病原菌对头孢他啶、庆大霉素、强力霉素3种药物敏感,对磺胺新诺明、头孢拉啶、青霉素等9种药物耐药;2株病原菌的基因型分别为HHL130:hly^+Aer^+Alt^-Act^+ahal^+ahp^+;HHL165:hly^+Aer^+Alt^-Act^+ahal^+ahp^-。

基于鲤疱疹病毒3型ORF65基因的DNA疫苗对建鲤鱼苗的免疫保护研究

为开发针对鲤疱疹病毒3 型(Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3)[又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)]的DNA 疫苗,该研究将CyHV-3 ORF65 插入pEGFP-N1,构建pEGFP-ORF65 重组质粒,通过转染实验与活体成像实验证实pORF65-EGFP 融合蛋白可以在建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)体外、体内表达;重组质粒按照3 μg·尾^-1 的剂量尾柄肌肉注射免疫10 g 左右的建鲤鱼苗,免疫3 次,ELISA 检测表明pEGFP-ORF65 免疫后可以显著提高血清特异性抗体水平;攻毒实验显示,CyHV-3 攻毒21 d 后,PBS 组、pEGFP-N1 组和pEGFPORF65组的建鲤成活率分别为25%、30%和90%,攻毒建鲤的成活率显著提高(P<0.01)。该研究为ORF65 作为DNA 疫苗靶基因应用于CyHV-3 的防控提供了依据。

罗非鱼无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除菌株的构建及其特性分析

Ⅶ型分泌系统存在于无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)中,其组成膜蛋白对底物蛋白的分泌转运至关重要。为此利用热敏型自杀质粒,构建了含氯霉素筛选标签的膜蛋白重组敲除载体pSET4s-ΔessA、pSET4s-ΔessB、pSET4s-ΔessC,经同源重组后,利用PCR技术筛选到了其缺失突变株-无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC。通过菌株生长曲线分析,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株均较野生株(WT)生长过程变慢,其中ΔessA、ΔessB敲除株在生长早期有显著性差异(P<0.01)。对ESAT6蛋白分泌影响分析显示,与WT株相比,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6的表达量均显著下调(P<0.01)。结果显示,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株均较WT株毒力显著降低(P<0.01)。研究表明,essA、essB、essC为无乳链球菌Ⅶ型分泌系统重要的膜蛋白,其基因缺失造成了分泌蛋白ESAT6 mRNA表达水平下降,影响了菌株毒力。